SNX-BARs هي بروتينات إعادة عرض الأغشية التي تلعب أدوارًا رئيسية في أمراض الإنسان. باستخدام أساليبنا، يمكننا تحديد خصائصها الفيزيائية الحيوية الدقيقة لتسهيل ربط الدهون وإعادة عرض الأغشية. تنقية البروتينات SNB-BAR من خلايا الخميرة يسمح الحصول على الأم homo و هيترو SNX-BAR الدايمات مع التقليل من السمية والذوبان كثيرا ما تواجه مع نظم التعبير غير الأصلية.
يمكن استخدام أساليبنا لفهم خصوصيات الدهون في جميع الخميرة SNX-BARs أو لإنتاج بروتينات SNX-BAR المؤتلفة من أي كائن حي آخر. تجميع الطارد الصحيح ضروري لمنع فقدان الدهون خلال عملية البثق. بالنسبة للطلاب المبتدئين أو الجدد في هذا المجال، فإن مراقبة الخطوات الأكثر أهمية بشكل كبير، سوف تحسن فرص نجاحك.
تبدأ من قبل تلقيح مسحة كبيرة من خلايا الخميرة في قارورة لا يقل عن أربعة أضعاف حجم الثقافة التي تحتوي على 50 ملليلتر من المتوسط YP القياسية تكملها 2٪ رافينوز و 0.1٪ الجلوكوز كمصدر للكربون وتنمو الثقافة بين عشية وضحاها في شاكر 30 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي، تلقيح 50 ملليلتر قبل الثقافة في لتر واحد من المتوسط YP القياسية مع 2٪ رافينوز و 0.1٪ الجلوكوز في حجم 2.8 لتر حيرت قارورة فرنباخ لثقافة أربع إلى خمس ساعات في حاضنة تهتز. عندما تصل الكثافة البصرية في 600 نانومتر 0.2، إضافة جالاكتوز إلى تركيز نهائي من 2٪ إلى الخلايا لثقافة بين عشية وضحاها في حاضنة اهتزاز.
في صباح اليوم التالي، حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي ونقل بيليه الخميرة إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. Resuspend بيليه في 15 ملليلتر من العازلة تنقية لتحقيق حجم النهائي من حوالي 30 ملليلتر وتحميل تعليق الخلية على التجانس مبردة إلى أربع درجات مئوية. Lyse العينات في 20 إلى 25، 000 جنيه لكل بوصة مربعة لمدة جولتين إلى ثلاث جولات ونقل lysate إلى أنبوب مخروطي جديد 50 ملليلتر على الجليد.
مسح الخلية فورا عن طريق الطرد المركزي ونقل بعناية عظمى في أنبوب جديد. المقبل، موازين 300 ميكرولترات من الخرز IgG Sepharose مع ثلاثة إعادة تعليق في العازلة تنقية قبل إضافة الخرز إلى الخلية مسح lysate لاحتضان لمدة ساعتين مع الدورية في أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة، إضافة الخرز إلى عمود كروماتوغرافيا 10 ملليلتر والسماح للlysate غير منضمة للتدفق من خلال.
غسل الخرز 10 مرات مع ملليلتر واحد من مخزن الغسيل في غسل السماح لكل غسل لتدفق من خلال تماما قبل إضافة وحدة التخزين المقبل. بعد الغسيل الأخير، استخدم ماصة ومخزنًا مؤقتًا جديدًا لنقل الخرز إلى أنبوب ميكرووستريفوغ. جلب الحجم الإجمالي للخرز إلى 500 ميكرولترات مع العازلة غسل الطازجة وإزالة الخرز من lysate مع اثنين من microliters من 10 ملليغرام لكل ملليلتر TEV protease لاحتضان بين عشية وضحاها مع التناوب في أربع درجات مئوية.
في صباح اليوم التالي، استخدم إبرة قياس 27 لإزالة ناظر تماما وتقييم نقاء البروتين بنسبة 10٪ بولياكريلاميد SDS الصفحة. ثم كمي البروتينات المركزة باستخدام تحليل البروتين برادفورد وفقا للبروتوكولات القياسية وتخزين البروتين لمدة تصل إلى أسبوع واحد في أربع درجات مئوية. لإعداد الدهون، واستخدام الحقن الزجاجية لنقل الدهون الأسهم في أنبوب ثقافة الزجاج نظيفة لتحقيق خليط الدهون النهائي من 1٪ فوسفاتيديلينوزيتول-3-الفوسفات، 20٪ ergosterol، 30٪ فوسفاتيديلسيرين، فوسفاتيديلكولين كما هو مبين في الجدول.
اعتمادا على المذيبات يتم إعادة تعليق كل الدهون في, قد يتحول الخليط غائما عند إضافة كل الدهون. جفف بعناية في خليط الدهون عن طريق توجيه منخفض التدفق غاز النيتروجين في الخلائط في حركة دائرية لعلاج الدهون بشكل موحد في الجزء السفلي من الأنبوب الزجاجي. ثم التفاف أنبوب الثقافة الزجاجية مع احباط ترك فتح كشف وتجفيف مزيد من الدهون في فراغ لمدة ساعة واحدة.
في نهاية الحضانة، إضافة 400 ميكرولتردات من العازلة ملزمة لكل قارورة لإعادة ترطيب الدهون تماما في تركيز ليبوسومات النهائي من 2.5 ملليمولار قبل إعادة تعليق الدهون بسرعة متوسطة على دوامة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. وينبغي أن تصبح عازلة غائمة كما يتم إعادة تعليق الدهون. نقل liposomded resuspended إلى أنبوب microcentrifuge وتجميد الأنابيب في النيتروجين السائل تليها ذوبان في حمام الماء 37 درجة مئوية سبع إلى ثماني مرات.
في غطاء الدخان الكيميائي، تنظيف اثنين من المحاقن الزجاج ملليلتر مع حجم كامل من الكلوروفورم ثلاث مرات لكل حقنة لإزالة أي الدهون المتبقية وتكسيد كل حقنة مع اثنين من وحدات التخزين من الماء فائقة السخاء واثنين من كميات من العازلة ملزمة. تجميع مصغرة الطارد وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. ثم غمر قطعتين من دعم التصفية في غشاء نانومتر واحد 200 في العازلة ملزمة.
من المهم تجميع الطارد المصغر بحيث يكون محكم الإغلاق تمامًا. وطريقة جيدة للتحقق من وجود تسرب هو تمرير المخزن المؤقت من خلال الجهاز. شطيرة الغشاء بين مرشح يدعم ووضع الغشاء في مصغرة الطارد.
باستخدام واحدة من المحاقن ملليلتر واحد مُعدّل، تمرير حجم من العازلة ملزمة مماثلة لحجم خليط liposome من خلال طارد صغير واستخدام حقنة أخرى لإسقاط خليط liposome عكس أنبوب microcenters لجمع آخر من liposomes في غطاء أنبوب لجمعها. ثم قذف الدهون من خلال 200 نانومتر غشاء 19 إلى 21 مرة وجمع ليبوسومات مقذوف في أنبوب جديد microcentrifuge. قبل تنفيذ SNX-BAR liposome ملزمة ومقايسات الأنابيب، قبل مسح البروتين النقي عن طريق الطرد الفائق ونقل المناطر إلى أنبوب جديد microcentrifuge دون إزعاج بيليه.
المقبل، احتضان أربعة micromolar من تنقية SNX4-ATG20 و 2.5 ملليمتر من liposomes في حجم التفاعل الكلي من 20 ميكرولترتر لاحتضان لمدة 30 دقيقة في 30 درجة مئوية. لتصور كمي ونبياض الدهون، في نهاية الحضانة، الفور بقعة العينات على شبكة شبكة النحاس المغلفة بالكربون وصمة عار سلبية مع 1٪ أورانيل خلات. ثم تحليل العينات على المجهر الإلكتروني انتقال في 200 كيلوفولت.
بالنسبة لربط الليبوسومات والترسب، قم بنقل 20 ميكرولترات من التفاعل مع أنبوب طرد مركزي بولي كربونات وتدور العينة مع جهاز توجيه متوافق في الطرد الفائق. في نهاية الطرد المركزي ، ونقل بعناية سوبربير إلى أنبوب جديد microcentrifuge وإعادة ربط بيليه في 40 ميكرولترات من المخزن المؤقت عينة الصفحة SDS. نقل تعليق بيليه إلى أنبوب جديد microcentrifuge وإضافة 20 ميكرولترات من العازلة عينة إلى supernatant.
ثم تحميل ما يعادل كميات العينة من بيليه وsupernatant على 10٪ polyacrylamide SDS هلام الصفحة وتنفيذ Coomassie تلطيخ لتصور SNX-BARs ملزمة liposomes. للتحقق من الحث السليم للتعبير SNX-BAR، يمكن استخدام لطخة غربية ضد علامة تنقية تقارب جنبا إلى جنب كما قد لا يتم الكشف عن مستويات البروتين من SNX-BARs عن طريق وصمة عار Coomassie. بعد تنقية heterodimer SNX-BAR، يجب أن تظهر نطاقات SNX-BARs في نسبة واحد إلى واحد stoichiometric وينبغي أن يكون هناك القليل من أي نطاقات ملوثة.
في هذا التحليل التمثيلي، تم التعبير عن الهتيروديمر SNX-BAR، وتنقيته، ومقيدة بالليبوسومات الاصطناعية كما هو مبين. لاحظ أن MVP1 شكلت متجانسات وتم التعبير عنها في البكتيريا كما هو متوقع. يمكن قياس SNX-BAR ملزم للتراكيب الدهنية المختلفة كمياً قياس الكثافة لتقييم آثار فوسفاتيديلسرين على سبيل المثال على ربط الليبوسومات.
التصوير المجهري للإلكترون يسمح بقياس أنابيب SNX4-ATG20 للزى مع معظم الأنابيب التي تمتلك عادة أقطار ما بين 14 إلى 26 نانومتر. لاحظ أنه يمكن إعادة تشكيل SNX-BARs المنقاة مع مجمعات التقاط البضائع على الليبوزومات لفهم كيف يمكن أن تؤثر التجميعات الكاملة على إعادة عرض الأغشية. عند مقارنة ربط تركيبات مختلفة من التميمات SNX-BAR المنقية إلى الدهون الاصطناعية التي تتألف من الدهون المختلفة، تم العثور على بروتينات SNX-BAR لامتلاك تفضيلات متميزة ربط الدهون.
اعمل دائماً في غطاء محرك السيارة عند التعامل مع الكلوروفورم وتأكد من ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند التعامل مع المواد الحادة أو الزجاجية.
