SNX-BARs são proteínas de remodelação de membranas que desempenham papéis-chave na doença humana. Usando nossos métodos, podemos determinar suas propriedades biofísicas precisas para facilitar a ligação lipídica e a remodelação da membrana. A purificação das proteínas SNB-BAR das células de levedura permite a aquisição de dimers homo nativos e hetero SNX-BAR, minimizando a toxicidade e insolubilidade frequentemente encontradas com sistemas de expressão não-nativos.
Nossos métodos podem ser usados para entender as especificidades lipídicas de todas as leveduras SNX-BARs ou para produzir proteínas SNX-BAR recombinantes de qualquer outro organismo. Um conjunto de extrusor correto é essencial para evitar a perda de lipossomos durante o processo de extrusão. Para os alunos iniciantes ou aqueles novos no campo, observar visualmente os passos mais críticos melhorará muito suas chances de sucesso.
Comece inoculando um grande cotonete de células de levedura em um frasco pelo menos quatro vezes o volume da cultura contendo 50 mililitros de YP médio padrão complementados com 2% raffinose e 0,1% de glicose como fonte de carbono e crescer a cultura durante a noite em um shaker Celsius de 30 graus. Na manhã seguinte, inocular a pré-cultura de 50 mililitros em um litro de média YP padrão com 2%raffinose e 0,1% de glicose em um volume de 2,8 litros confundiu o frasco de Fernbach por uma cultura de quatro a cinco horas na incubadora de agitação. Quando a densidade óptica em 600 nanômetros atingir 0,2, adicione galactose a uma concentração final de 2% às células para uma cultura noturna na incubadora de agitação.
Na manhã seguinte, colde células por centrifugação e transfira a pelota de levedura para um tubo cônico de 50 mililitros. Resuspengue a pelota em 15 mililitros de tampão de purificação para obter um volume final de cerca de 30 mililitros e carregue a suspensão da célula em um homogeneizador refrigerado a quatro graus Celsius. Lyse as amostras de 20 a 25.000 libras por polegada quadrada por duas a três rodadas e transfira o lysate para um novo tubo cônico de 50 mililitros no gelo.
Limpe imediatamente o lisecelular por centrifugação e transfira cuidadosamente o sobrenante para um novo tubo. Em seguida, equilibre 300 microliters de contas IgG Sepharose com três re-suspensões no tampão de purificação antes de adicionar as contas ao lysate celular limpo para uma incubação de duas horas com rotação a quatro graus Celsius. No final da incubação, adicione as contas a uma coluna de cromatografia de 10 mililitros e permita que o lysate desvinculado flua.
Lave as contas 10 vezes com um mililitro de tampão de lavagem por lavagem, permitindo que cada lavagem flua completamente antes de adicionar o próximo volume. Após a última lavagem, use uma pipeta e um tampão fresco para transferir as contas para um tubo de microcentrifutura. Leve o volume total das contas para 500 microliters com tampão de lavagem fresco e remova as contas do lysate com dois microliters de 10 miligramas por mililitro TEV protease para uma incubação noturna com rotação a quatro graus Celsius.
Na manhã seguinte, use uma agulha de calibre 27 para remover completamente o sobrenante e avaliar a pureza proteica por 10% de policlamida página SDS. Em seguida, quantifique as proteínas concentradas usando o ensaio proteico de Bradford de acordo com os protocolos padrão e armazene a proteína por até uma semana a quatro graus Celsius. Para preparar os lipossomos, use seringas de vidro para transferir lipídios de estoque para um tubo de cultura de vidro limpo para alcançar uma mistura lipídica final de 1%fosfaticdylinositol-3-fosfato, 20% ergosterol, 30% fosfatidylserina, fosfatidylcholina como descrito na tabela.
Dependendo dos solventes em que cada lipídio é resuspendido, a mistura pode ficar nublada após a adição de cada lipídio. Seque cuidadosamente as misturas lipídicas direcionando gás nitrogênio de baixo fluxo para as misturas em um movimento circular para tratar os lipídios uniformemente na parte inferior do tubo de vidro. Em seguida, enrole o tubo de cultura de vidro com papel alumínio deixando a abertura descoberta e desidratando ainda mais os lipídios no vácuo por uma hora.
No final da incubação, adicione 400 microliters de tampão de ligação a cada frasco para reidratar completamente os lipídios em uma concentração lipossa final de 2,5 mililitros antes de reutilizar os lipídios em velocidade média em um vórtice à temperatura ambiente por 30 minutos. O tampão deve ficar nublado à medida que os lipídios são resuspended. Transfira os lipossomos resuspendados para um tubo de microcentrífuga e congele os tubos em nitrogênio líquido seguido de descongelamento em um banho de água de 37 graus Celsius sete a oito vezes.
Em um capô de fumaça química, limpe duas seringas de vidro de um mililitro com um volume total de clorofórmio três vezes por seringa para remover quaisquer lipídios residuais e equilibrar cada seringa com dois volumes de água ultrauso e dois volumes de tampão de ligação. Monte um mini-extrusor de acordo com as recomendações do fabricante. Em seguida, submergir dois pedaços de suporte de filtro em uma membrana de 200 nanômetros em tampão de ligação.
É importante montar o mini-extrusor para que ele seja completamente hermético. E uma boa maneira de verificar se há vazamentos é passar buffer através do dispositivo. Sanduiche a membrana entre os suportes do filtro e coloque a membrana no mini-extrusor.
Usando uma das seringas de um mililitro equilibrado, passe um volume de tampão de ligação semelhante ao volume da mistura lipossorosa através do mini-extrusor e use a outra seringa para soltar a mistura lipossa invertendo o tubo de microcentrifuuge para coletar o último dos lipossomos na tampa do tubo para sua coleta. Em seguida, extrude os lipossomos através da membrana de 200 nanômetros 19 a 21 vezes e colete os lipossomos extrudados em um novo tubo de microcentrífuga. Antes de realizar os ensaios de ligação lipossomo SNX-BAR e ensaios de tubulação, pré-limpe a proteína purificada por ultracentrifugação e transfira o supernatante para um novo tubo de microcentrifuuagem sem perturbar a pelota.
Em seguida, incubar quatro micromolar de SNX4-ATG20 purificados e 2,5 mililitros de lipossomos em um volume total de reação de 20 microliters para uma incubação de 30 minutos a 30 graus Celsius. Para visualizar e quantificar a tubulação lipossa, no final da incubação, localize imediatamente as amostras em uma grade de malha de cobre revestida de carbono e mancha negativa com acetato de 1%uranyl. Em seguida, analise as amostras em um microscópio eletrônico de transmissão a 200 kilovolts.
Para ligação liposódica e sedimentação, transfira 20 microlitadores da reação para um tubo de centrífuga de policarbonato e gire a amostra com um roteador compatível em uma ultracentrifuagem. No final da centrifugação, transfira cuidadosamente o supernante para um novo tubo de microcentrifuuagem e resuspenda a pelota em 40 microliters de buffer de amostra de página SDS. Transfira a suspensão da pelota para um novo tubo de microcentrifuuagem e adicione 20 microliters de tampão de amostra ao supernascer.
Em seguida, carregue volumes de amostras equivalentes de pelota e supernascer em um gel de página SDS de 10% de poliacrilamida e execute a coloração coomassie para visualizar os SNX-BARs ligados aos lipossomos. Para verificar se há indução adequada da expressão SNX-BAR, uma mancha ocidental contra a etiqueta de purificação de afinidade tandem pode ser usada, pois os níveis de proteína dos SNX-BARs podem não ser detectados através da mancha de Coomassie. Após a purificação do heterodimer SNX-BAR, as bandas dos dois SNX-BARs devem aparecer em uma relação estequiométrica de um para um e deve haver pouca ou nenhuma banda contaminante.
Nesta análise representativa, os heterodimers SNX-BAR foram expressos, purificados e ligados a lipossomos sintéticos como demonstrado. Note que o MVP1 formou homodimers e foi expresso em bactérias como esperado. A ligação SNX-BAR a diferentes composições lipossas poderia ser quantificada por densitometria para avaliar os efeitos da fosfatidíserina, por exemplo, na ligação lipossosom.
A imagem de microscopia eletrônica permite a medição de túbulos lipossois SNX4-ATG20 com a maioria dos túbulos tipicamente possuindo diâmetros entre 14 e 26 nanômetros. Observe que sNX-BARs purificados podem ser reconstituídos com complexos de captura de carga em lipossomos para entender como montagens completas podem influenciar a remodelação da membrana. Ao comparar a ligação de diferentes combinações de dimers SNX-BAR purificados com lipossomos sintéticos compostos por liposetos diferentes, as proteínas SNX-BAR foram encontradas possuindo preferências distintas de ligação lipídica.
Sempre trabalhe em um capô ao manusear clorofórmio e certifique-se de usar o EPI adequado ao manusear afiadas ou material de vidro.
