ביטוי, טיהור, וליפוזום קשירה של שמרים מסוג SNX-BAR הטרודיורס

SNX-BARs הם חלבונים שיפוץ קרום לשחק תפקידי מפתח במחלות אנושיות. באמצעות השיטות שלנו, אנו יכולים לקבוע את המאפיינים הביופיזיים המדויקים שלהם כדי להקל על קשירה שומנים ושיפוץ קרום. טיהור חלבוני SNB-BAR מתאים שמרים מאפשר רכישה של דימרים מקוריים של הומואים והטרו SNX-BAR תוך מזעור הרעילות וחדלות הפירעון שנתקלים בהם לעתים קרובות עם מערכות ביטוי שאינן מקוריות.

השיטות שלנו ניתן להשתמש כדי להבין את הספציפיות השומנים של כל שמרים SNX-BARs או לייצר חלבונים SNX-BAR רקומביננטי מכל אורגניזם אחר. הרכבה נכונה של שולט חיונית למניעת אובדן ליפוזום במהלך תהליך ההבלטה. עבור סטודנטים מתחילים או חדשים בתחום, התבוננות ויזואלית בצעדים הקריטיים ביותר תשפר מאוד את סיכויי ההצלחה שלך.

התחל על ידי חיסון ספוגית גדולה של תאי שמרים לתוך בקבוקון לפחות ארבע פעמים את נפח התרבות המכילה 50 מיליליטר של מדיום YP סטנדרטי בתוספת 2%raffinose ו 0.1% גלוקוז כמקור פחמן ולהגדיל את התרבות לילה שייקר 30 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, לחסן את 50 מיליליטר טרום תרבות בליטר אחד של מדיום YP סטנדרטי עם 2%raffinose ו 0.1% גלוקוז בנפח 2.8 ליטר בלבל בקבוק פרנבאך לתרבות של ארבע עד חמש שעות באינקובטור רועד. כאשר הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר מגיע 0.2, להוסיף גלקטוז לריכוז סופי של 2% לתאים לתרבות לילה באינקובטור רועד.

למחרת בבוקר, לקצור תאים על ידי צנטריפוגה ולהעביר את גלולת שמרים לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר. תן את גלולה ב 15 מיליליטר של חיץ טיהור כדי להשיג נפח סופי של כ 30 מיליליטר ולהעמיס את ההשעיה התא על homogenizer מקורר לארבע מעלות צלזיוס. Lyse הדגימות ב 20 כדי 25, 000 פאונד לאינץ 'מרובע במשך שניים עד שלושה סיבובים ולהעביר את lysate לתוך צינור חרוט חדש 50 מיליליטר על קרח.

מיד לנקות את התא lysate על ידי צנטריפוגה בזהירות להעביר את supernatant לתוך צינור חדש. לאחר מכן, לצייד 300 microliters של חרוזי IgG Sepharose עם שלושה מתלים מחדש במאגר טיהור לפני הוספת חרוזים לתא פינה lysate עבור דגירה של שעתיים עם סיבוב בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, מוסיפים את חרוזים לעמוד כרומטוגרפיה של 10 מיליליטר ומאפשרים לליסנט הלא מאוגד לזרום דרכו.

לשטוף את חרוזים 10 פעמים עם מיליליטר אחד של חיץ לשטוף לכל לשטוף המאפשר לכל לשטוף לזרום דרך לחלוטין לפני הוספת הנפח הבא. לאחר הכביסה האחרונה, השתמש פיפטה חיץ טרי כדי להעביר את חרוזים לתוך צינור microcentrifuge. להביא את הנפח הכולל של חרוזים ל 500 microliters עם חיץ לשטוף טרי ולהסיר את חרוזים מן lysate עם שני microliters של 10 מיליגרם למיליליטר TEV פרוטאז עבור דגירה לילה עם סיבוב בארבע מעלות צלזיוס.

למחרת בבוקר, להשתמש במחט מד 27 כדי להסיר את העל טבעי לחלוטין ולהעריך את טוהר החלבון על ידי 10% polyacrylamide SDS דף. לאחר מכן לכמת את החלבונים המרוכזים באמצעות מיסי חלבון ברדפורד על פי פרוטוקולים סטנדרטיים ולאחסן את החלבון עד שבוע בארבע מעלות צלזיוס. כדי להכין את ליפוזומים, להשתמש במזרקי זכוכית כדי להעביר שומנים במלאי לתוך צינור תרבות זכוכית נקייה כדי להשיג תערובת שומנים סופית של 1%פוספטידילינוזיטול-3-פוספט, 20%ergosterol, 30%פוספטידילסרין, פוספטידילכולין כמתואר בטבלה.

בהתאם ממסים כל שומנים הוא resuspended ב, התערובת עשויה להפוך מעונן על תוספת של כל השומנים. בזהירות לייבש את תערובות השומנים על ידי הפניית גז חנקן בזרימה נמוכה על תערובות בתנועה מעגלית לטיפול שומנים באופן אחיד בתחתית צינור הזכוכית. ואז לעטוף את צינור תרבות הזכוכית עם נייר כסף עוזב את הפתח חשוף עוד יותר לייבש את השומנים בוואקום במשך שעה אחת.

בסוף הדגירה, מוסיפים 400 מיקרוליטרים של חיץ מחייב לכל בקבוקון כדי לייבש לחלוטין את השומנים בריכוז ליפוזום סופי של 2.5 מילימולרים לפני שימוש חוזר בשומנים במהירות בינונית על מערבולת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. החיץ צריך להיות מעונן כמו שומנים הם resuspended. מעבירים את ליפוזומים המתווסכלים לצינור מיקרוצנטריפוגה ומקפיאים את הצינורות בחנקן נוזלי ואחריו הפשרה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס שבע עד שמונה פעמים.

במכסה המנוע של אדים כימיים, נקה שני מזרקי זכוכית מיליליטר אחד עם נפח מלא של כלורופורם שלוש פעמים לכל מזרק כדי להסיר את כל השומנים שיורית לצייד כל מזרק עם שני כרכים של מים ultrapure ושני כרכים של חיץ מחייב. להרכיב מיני extruder על פי המלצות היצרן. לאחר מכן תטביע שתי חתיכות של תמיכה במסנן בממברנה אחת של 200 ננומטר במאגר כריכה.

חשוב להרכיב את ה- mini-extruder כך שהוא אטום לחלוטין. ודרך טובה לבדוק אם יש דליפות היא להעביר חיץ דרך המכשיר. כריך את הממברנה בין תומך המסנן והנח את הממברנה במיני-אקסטרודר.

באמצעות אחד המזרקים מיליליטר אחד, להעביר נפח של חיץ מחייב דומה לנפח של תערובת ליפוזום דרך mini-extruder ולהשתמש במזרק השני כדי להפיל את תערובת ליפוזום היפוך צינור microcentrifuge כדי לאסוף את האחרון של ליפוזומים לתוך כובע הצינור עבור האוסף שלהם. ואז להחדיר את ליפוזומים דרך קרום 200 ננומטר 19 עד 21 פעמים ולאסוף את ליפוזומים מובלטים לתוך צינור microcentrifuge חדש. לפני ביצוע בדיקות קשירה וחוסם ליפוזום SNX-BAR, לנקות מראש את החלבון המטוהר על ידי אולטרהצנטריפוגה ולהעביר את supernatant לצינור microcentrifuge חדש מבלי להפריע גלולה.

לאחר מכן, הדגירה ארבעה micromolar של SNX4-ATG20 מטוהרים ו 2.5 מילימולר של ליפוזומים בנפח התגובה הכולל של 20 microliters עבור דגירה של 30 דקות ב 30 מעלות צלזיוס. כדי לדמיין ולכרות את צינורית ליפוזום, בסוף הדגירה, מיד לזהות את הדגימות על רשת נחושת מצופה פחמן וכתם שלילי עם 1% אורניל אצטט. ואז לנתח את הדגימות על מיקרוסקופ אלקטרונים שידור ב 200 קילובולטים.

עבור קשירה liposome ומעים, להעביר 20 microliters של התגובה צינור צנטריפוגה פוליקרבונט ולסובב את המדגם עם נתב תואם אולטרהצנטריפוגה. בסוף הצנטריפוגה, בזהירות להעביר את supernatant לצינור microcentrifuge חדש resuspend גלולה ב 40 microliters של מאגר מדגם דף SDS. העבר את ההשעיה גלולה לצינור microcentrifuge חדש ולהוסיף 20 microliters של מאגר מדגם על טבעי.

לאחר מכן לטעון כמויות מדגם שוות ערך של גלולה ועל טבעי על 10%polyacrylamide SDS ג'ל דף ולבצע כתמים קומאסי כדי לדמיין את SNX-BARs מאוגד ליפוזומים. כדי לבדוק אינדוקציה נכונה של ביטוי SNX-BAR, כתם מערבי נגד תג טיהור זיקה טנדם יכול לשמש כמו רמות החלבון של SNX-BARs לא ניתן לזהות באמצעות כתם קומאסי. לאחר טיהור ההטרודימר SNX-BAR, הרצועות של שני SNX-BARs אמורות להופיע ביחס סטואיכומטרי של אחד לאחד ולא אמורות להיות מעט להקות מזהמות.

בניתוח מייצג זה, הטרודימרים SNX-BAR באו לידי ביטוי, מטוהרים, וכבול ליפוזומים סינתטיים כפי שהוכח. שים לב כי MVP1 יצר הומודימרים והתבטא בחיידקים כצפוי. SNX-BAR מחייב קומפוזיציות ליפוזום משתנות יכול להיות מכומת על ידי densitometry כדי להעריך את ההשפעות של phosphatidylserine למשל על איגוד ליפוזום.

הדמיה מיקרוסקופית אלקטרונים מאפשרת את המדידה של צינוריות ליפוזום SNX4-ATG20 עם רוב הצינוריות בדרך כלל בעל קטרים בין 14 ל 26 ננומטר. שים לב כי SNX-BARs מטוהרים ניתן reconstituted עם מתחמי לכידת מטען על ליפוזומים כדי להבין כיצד הרכבות מלאות יכול להשפיע על שיפוץ קרום. כאשר משווים את הכריכה של שילובים שונים של עמעומי SNX-BAR מטוהרים לליפוזומים סינתטיים המורכבים משומנים שונים, נמצאו חלבוני SNX-BAR בעלי העדפות מחייבות שומנים ברורות.

תמיד לעבוד ברדס בעת טיפול כלורופורם הקפד ללבוש את PPE הנכון בעת טיפול חדים או חומר זכוכית.