SNX-BARs - это мембранные ремоделирования белков, которые играют ключевую роль в болезни человека. Используя наши методы, мы можем определить их точные биофизические свойства для облегчения связывания липидов и мембранной ремоделирования. Очистка белков SNB-BAR из дрожжевых клеток позволяет приобретение местных гомо и гетеро SNX-BAR димеров при минимизации токсичности и неразрешимости часто встречаются с неродными системами выражения.
Наши методы могут быть использованы для понимания липидных особенностей всех дрожжей SNX-BARs или для производства рекомбинантных белков SNX-BAR из любого другого организма. Правильная сборка экструдера имеет важное значение для предотвращения потери липосомы во время процесса экструзии. Для начинающих студентов или тех, кто нов в этой области, визуальное наблюдение за наиболее важными шагами значительно повысит ваши шансы на успех.
Начните с интокуляции большой тампон дрожжевых клеток в колбу по крайней мере в четыре раза объем культуры, содержащей 50 миллилитров стандартной среды YP дополнены 2%raffinose и 0,1%глюкозы в качестве источника углерода и расти культуры ночь в 30 градусов по Цельсию шейкер. На следующее утро, привить 50 миллилитров до культуры в одном литре стандартной среды YP с 2%raffinose и 0,1% глюкозы в 2,8-литровый объем сбит с толку Фернбах колбу для четырех до пяти часов культуры в трясущимся инкубаторе. Когда оптическая плотность на 600 нанометров достигает 0,2, добавьте галактозу в окончательную концентрацию 2%к клеткам для ночной культуры в трясущимся инкубаторе.
На следующее утро, урожай клеток центрифугации и передачи дрожжевых гранул в 50 миллилитров конической трубки. Переподходите гранулы в 15 миллилитров буфера очистки, чтобы достичь конечного объема около 30 миллилитров и загрузить подвеску клетки на гомогенизатор охлажденной до четырех градусов по Цельсию. Lyse образцов на 20 до 25000 фунтов на квадратный дюйм в течение двух-трех раундов и передачи лизата в новый 50 миллилитров конической трубки на льду.
Немедленно очистите лизат клетки центрифугой и тщательно перенесите супернатант в новую трубку. Далее, equilibrate 300 микролитров IgG Sepharose бусы с тремя повторно суспензии в буфере очистки, прежде чем добавить шарики в очищенной клетке лизать в течение двух часов инкубации с вращающейся при четырех градусах по Цельсию. В конце инкубации добавьте шарики в 10-миллилитровый хроматографический столбец и позвольте несырью ликат протекать.
Вымойте шарики 10 раз с одним миллилитром буфера мытья на стирку позволяет каждой стирки течь через полностью, прежде чем добавить следующий объем. После последней стирки используйте пипетку и свежий буфер для переноса бисера в трубку микроцентрифуга. Довнесите общий объем бисера до 500 микролитров со свежим буфером стирки и удалите бусинки из лизата двумя микролитрами по 10 миллиграмм на миллилитр протеазы TEV для ночной инкубации с вращением при четырех градусах Цельсия.
На следующее утро используйте 27 калибровочных игл, чтобы удалить супернатант полностью и оценить чистоту белка на 10%полиакриламид SDS странице. Затем количественно концентрированных белков с использованием Брэдфорд белка анализа в соответствии со стандартными протоколами и хранить белок на срок до одной недели при четырех градусах по Цельсию. Чтобы подготовить липосомы, используйте стеклянные шприцы для передачи запасов липидов в чистую стеклянную трубку культуры для достижения окончательной липидной смеси 1%фосфатидилинозитол-3-фосфат, 20%эргостерол, 30%фосфатидилсерин, фосфатидилхолин, как указано в таблице.
В зависимости от растворителей каждый липид повторно, смесь может оказаться облачно с добавлением каждого липида. Тщательно высушите липидные смеси, направляя низкотекутный азотный газ на смеси круговыми движениями для равномерной лечения липидов в нижней части стеклянной трубки. Затем оберните стеклянную трубку культуры фольгой оставляя отверстие обнаружили и дальнейшей обезвоживания липидов в вакууме в течение одного часа.
В конце инкубации добавьте 400 микролитров связывающего буфера к каждому флакону, чтобы полностью увлажнить липиды при окончательной концентрации липосомы 2,5 миллимолара, прежде чем повторно использовать липиды на средней скорости вихря при комнатной температуре в течение 30 минут. Буфер должен стать облачным, так как липиды перерасходуются повторно. Перенесите перерасход липосомы в трубку микроцентрифуга и заморозьте трубки в жидком азоте, а затем оттаивание в водяной бане 37 градусов по Цельсию семь-восемь раз.
В химическом дымовом капюшоне очистите два одноми миллилитровых стеклянных шприца с полным объемом хлороформа три раза на шприц, чтобы удалить остатки липидов и уравночные каждый шприц с двумя томами ультрапурной воды и двумя томами связывающего буфера. Соберите мини-экструдер в соответствии с рекомендациями производителя. Затем погрузите два куска поддержки фильтра в одну 200-нанометровую мембрану в связывающий буфер.
Важно собрать мини-экструдер так, чтобы он был полностью герметичным. И хороший способ проверить утечки является пройти буфер через устройство. Сэндвич мембраны между фильтром поддерживает и поместите мембрану в мини-экструдер.
Используя один из equilibrated один миллилитр шприцы, пройти объем связывающего буфера похож на объем липосомной смеси через мини-экструдер и использовать другой шприц, чтобы падение липосомной смеси инвертирования микроцентрифуг трубки для сбора последнего из липосом в трубку крышку для их коллекции. Затем экструдировать липосомы через 200 нанометровую мембрану от 19 до 21 раз и собирать экструдированные липосомы в новую микроцентрифугную трубку. Перед выполнением анализа липосомы SNX-BAR и трубуляции предварительно очистите очищенный белок путем ультрацентрифугации и перенесите супернатант в новую микроцентрифугную трубку, не нарушая гранулы.
Далее инкубируют четыре микромолара очищенных SNX4-ATG20 и 2,5 миллимолара липосом в общем объеме реакции 20 микролитров для 30-минутной инкубации при 30 градусах Цельсия. Чтобы визуализировать и количественно липосомы трубоукупления, в конце инкубации, сразу же месте образцов на углеродного покрытия медной сетки сетки и отрицательное пятно с 1%уранил ацетат. Затем проанализируйте образцы на электронном микроскопе передачи на 200 киловольт.
Для липосомного связывания и осаждения перенесите 20 микролитров реакции на поликарбонатную центрифугу трубки и вращаем образец с совместимым маршрутизатором в ультрацентрифуге. В конце центрифугации тщательно перенесите супернатант в новую микроцентрифугную трубку и повторно посовелите гранулы в 40 микролитров буфера образца страницы SDS. Перенесите подвеску гранулы в новую трубку микроцентрифуга и добавьте 20 микролитров буфера образца к супернатанту.
Затем загрузите эквивалентные объемы образца гранул и супернатанта на 10%полиакриламид SDS страницу гель и выполнить Coomassie окрашивания для визуализации SNX-BARs связаны с липосомами. Для проверки правильной индукции экспрессии SNX-BAR, западная помарка против тега очистки сродства тандема может быть использована, поскольку уровни белка SNX-BARs не могут быть обнаружены через пятно Кумасси. После очистки гетенодимера SNX-BAR полосы двух SNX-BARs должны отображаться в соотношении один к одному и не должно быть практически никаких загрязняющих полос.
В этом репрезентативном анализе гетенодимеры SNX-BAR были выражены, очищены и привязаны к синтетическим липосомам, как это было продемонстрировано. Обратите внимание, что MVP1 формируется гомодимеры и выражается в бактериях, как ожидалось. Связывание SNX-BAR с различными липосомными композициями может быть количественно количественно с помощью денситометрии для оценки влияния фосфатидилсерина, например, на липосомную привязку.
Электронная микроскопическая визуализация позволяет измерять липосомные трубоубийки SNX4-ATG20 с большинством труб, обычно обладающих диаметром от 14 до 26 нанометров. Обратите внимание, что очищенные SNX-BARs могут быть восстановлены с грузоподъемными комплексами на липосомах, чтобы понять, как полные сборки могут влиять на реконструкцию мембраны. При сравнении связывания различных комбинаций очищенных димеров SNX-BAR с синтетическими липосомами, состоящими из различных липидов, было установлено, что белки SNX-BAR обладают различными предпочтениями связывания липидов.
Всегда работайте в капюшоне при обработке хлороформа и не забудьте носить надлежащий СИЗ при обработке острых или стеклянных материалов.
