هذا سير عمل البروتيوميكس تمكن من تحديد غير متحيز ورسم خرائط لتفاعلات البروتين البروتينية الذاتية مع الدقة دون الخلوية. هذه التقنية مفيدة بشكل خاص عند التحقيق في بروتينات الطعم التي هي الجرعة الحساسة, وفرة منخفضة, أو يكون لها تعريبات متعددة دون الخلوية. يمكن تطبيق هذه الطريقة لرسم خرائط تفاعلات البروتين الذاتية على افتراض وجود كاشف تقارب مناسب متاح.
وهذا أمر مهم بشكل خاص بالنسبة للعديد من الآلاف من البروتينات التي لها وظيفة غير معروفة ، وكثير منها مرتبط بمرض بشري. يمكن تكييف هذه الطريقة مع أي خط الخلية أو الأنسجة القابلة للكسر تحت الخلية. يمكن استهداف أي بروتين مع كاشف تقارب مناسب.
والنتيجة الشائعة لتجارب تنقية التقارب هي في كثير من الأحيان لا توجد نتيجة. الكواشف جيدة حقا، وجمع بيانات مراقبة الجودة في جميع أنحاء، والحد من التعامل مع العينة كلها مهمة حقا. اعلم أن لديك عينة.
للبدء، ذوبان الكريات الخلية المعدة لمدة 15 دقيقة في 1X حجم بيليه من المخزن المؤقت البارد A مع مثبطات البروتياز أو مثبطات الفوسفاتاز. وضع أنبوب يحتوي على بيليه الخلية على nutator في أربع درجات مئوية للمساعدة في إعادة النيوسيون لمدة 30 دقيقة. ثم ضع الأنبوب في جهاز طرد مركزي عند 2000 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق إلى بيليه.
decant فائقة و resuspend الخلايا مع 5X حجم الخلية معبأة مع العازلة A.Incubate على الجليد لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، بيليه مرة أخرى في 2،000 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. Decant العازلة و resuspend مع 2X الأصلي تخزين الخلية المخزن المؤقت A مع مثبطات البروتياز أو مثبطات فوسفاتاز.
Dounce حوالي سبع مرات مع الآفة فضفاضة A.Centrifuge لlysate لمدة 10 دقيقة في 2، 000 مرة ز وأربع درجات مئوية. نقل بعناية فائقة إلى أنبوب جديد وفلاش تجميده مع النيتروجين السائل. تخزين ال ليسات في ناقص 80 درجة مئوية.
Resuspend بيليه مع 0.9X حجم بيليه من العازلة B مع مثبطات البروتياز أو مثبطات الفوسفاتاز ومزيج على nutator لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. لlyslyse النوى ، dounce 20 مرة مع titer pestle B.Mix الليسات النووية على nutator لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية بحيث يكون متجانسا. ثم الطرد المركزي النووي لمدة 30 دقيقة في 21،000 مرة ز في أربع درجات مئوية.
الماصات قبالة مُندفع ويُحفظ كمستخرج بروتين نووي قابل للذوبان. لـ dialyze استخراج النووية القابلة للذوبان، قطع أولا طول مناسب من 24 ملليمتر عرض أنابيب غسيل الكلى مع قطع الوزن الجزيئي 8 كيلودالتون. المشبك جانب واحد من الأنابيب وتحميل النوى في الأنابيب.
بعد تحميل lysate، المشبك الطرف الآخر وغمر في وعاء زجاجي نظيف يحتوي على العازلة C مع مثبطات البروتياز. دياليزي لمدة ثلاث ساعات في أربع درجات مئوية. بعد ذلك، نقل النووي استخراج النووية dialyzed استخراج nucleoplasm في أنبوب والطرد المركزي في 21،000 مرات ز في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
نقل ثلاثة 20 ميكرولتر aliquots من استخراج النووية إلى أنابيب جديدة microcentrifuge للتحقق من تجزئة بواسطة لطخة الغربية. باستخدام نصائح الماصات التي تم قطعها في الطرف، وإعداد بروتين A / G خليط حبة لكل تكرار من خلال الجمع بين 12.5 حجم حبة ميكرولتر من البروتين A Sepharose مع 12.5 ميكرولترات من البروتين G Sepharose في أنابيب microcentrifuge. غسل البروتين A / G خليط حبة مرتين مع 300 ميكرولترات من IP العازلة I.Spin الخرز في 1، 500 مرات ز في أربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة وdedeant العازلة.
المقبل، وإعداد البروتين المضادة A / G الخرز. لربط الأجسام المضادة إلى الخرز، إضافة إلى أنبوب 300 ميكرولترات من IP العازلة I و 10 ميكروغرام من الأجسام المضادة المطلوبة. السماح لخليط الايضاح حبة الصخور على nutator في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
الآن aliquot وحدات التخزين المناسبة من lysates النووية في انخفاض الاحتفاظ أنابيب microcentrifuge لميغرام واحد من البروتين المدخلات لكل تكرار. تدور في lysate 16، 000 مرات ز لمدة 30 دقيقة ونقل sunatant إلى أنبوب جديد. إضافة ميكرولتر واحد من Benzonase في 250 وحدة لكل ميكرولتر لكل ملليغرام من lysate النووية والصخور على nutator في أربع درجات مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة.
لإعداد الخرز لتطهير ما قبل lysate، إضافة 12.5 ميكرولترات من كل بروتين A والبروتين G الخرز إلى 1.5 ملليلتر أنابيب الاحتفاظ منخفضة. غسل مرتين مع IP غسل العازلة الأول مع مثبطات البروتياز. Decant العازلة وإضافة ملليغرام واحد من lysate النووية المعدة إلى الخرز.
احتضان بينما هزاز على nutator لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي مسح مسبقا في 1، 500 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. ثم غسل بروتين الأجسام المضادة A أو G الخرز مرتين مع IP العازلة أنا مع مثبطات البروتياز.
بعد الطرد المركزي في 1، 500 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة، decant العازلة. الآن نقل lysate النووية تطهيرها مسبقا على بروتين الأجسام المضادة A أو G الخرز. احتضان بينما هزاز على nutator في أربع درجات مئوية لمدة أربع ساعات.
وبعد الحضانة، أجهزة الطرد المركزي في 1،500 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. نقل المابير إلى أنابيب المسمى كتدفق من خلال لكل تكرار. غسل البروتين المضادة أ أو G الخرز أربع مرات مع ملليلتر واحد من IP العازلة الثاني مع مثبطات البروتياز.
ثم غسل الخرز مرتين مع ملليلتر واحد من IP العازلة أنا مع مثبطات البروتياز. تأكد من إزالة كل العازلة بعد الغسيل الماضي. بروتين Elute قبالة الخرز عن طريق احتضان مع 20 ميكرولترات من 0.1 جليسين المول في 2.75 pH لكل لمدة 30 دقيقة على nutator.
ثم تدور في 750 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة والماصة قبالة supernatant. كرر هذه الحضانة مع عازلة elution للمرة الثانية. بعد إعداد بيليه البروتين، resuspend مع 30 ميكرولترات من المخزن المؤقت alkylation SDS.
احتضان العينة على كتلة حرارة 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم ندعه يبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. إضافة 300 ملليلتر من حل UA و 30 ميكرولترات من TCEP 100 ملليمولار لكل عينة.
قم بتحميل الحل على فلتر الطرد المركزي 30K. بعد الغزل فلتر الطرد المركزي في 21، 000 مرات ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق، والحفاظ على تدفق من خلال في حالة وجود مشكلة مع مرشح. بعد غسل المرشح وفقا للمخطوطة، إضافة ثلاثة ميكرولترات من ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر lyse C resuspended في 0.1 المول تريس pH 8.5.
ملء المرشحات تصل إلى علامة 100 ميكرولتر مع 0.1 مُلَسِسِس 8.5. السماح له الهضم لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية في حين هزاز على nutator. المقبل، إضافة ميكرولتر واحد من ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر MS الصف التربسين.
مزيج بلطف والسماح للتريبسين لاحتضان مع عينة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حين هزاز على nutator. في الصباح، الطرد المركزي عدة مرات في 21،000 مرات ز لمدة 20 دقيقة لlute الببتيدات من المرشح إلى أنبوب الاستبقاء المنخفضة نظيفة microcentrifuge. بعد إزالة الببتيدات باستخدام الأعمدة تدور C18، resuspend الببتيدات الlyophilized في سبع ميكروليترات من 0.1٪ TFA في 5٪ الأسيتونتريل.
سونيكات العينة لمدة ثلاث دقائق لضمان أن الببتيدات قد تم إعادة تعليق، ثم تدور أسفل في 14، 000 مرات ز لمدة 10 دقائق. تحميل 15 إلى 30٪ من العينة على نظام قياس الطيف الكتلي اللوني السائل للتحليل. في هذه الدراسة، تم تحليل التحلل المناعي ثلاثية التخصصات من خمسة ملليغرام من استخراج HeLa النووي باستخدام عنصر تحكم حبة فقط.
الطعم DYRK1A في المرتبة بين البروتينات الثلاثة العليا المخصب على السيطرة مما يدل على إجراء IP-MS التجربة كان موثوقا بها. وقد تبين فصل واضح بين التفاعلات الثقة العالية وأكبر من 95٪ من البروتينات المشتركة تم تحديدها على أنها غير محددة. على سبيل المثال DYRK1A مجموعة البيانات، قدم شركاء التفاعل IREF قيم FC-A منخفضة كـ 0.45 تمثل إثراء منخفض جداً على التحكم.
وبناء على ذلك، فإن العديد من هذه التفاعلات التي تم الإبلاغ عنها سابقاً هي سلبيات زائفة داخل مجموعة البيانات هذه من خلال الانخفاض تحت عتبة FC-A وهي ثلاثة. لم يظهر عدد النسخ المطلق المحسوب لكل تفاعل IREF أي ارتباط بمستويات الكشف عن أحد شركاء التفاعل بواسطة IP-MS. الاستخدام المشترك لـ FC-A أكبر من ثلاثة والقديس أكبر من 0.9 قلل من قائمة المتفاعلين عالية الثقة إلى ستة بروتينات.
ومع ذلك، عند تطبيق قطع FC-A من أكبر من ثلاثة في عزلة، تمت إضافة ثمانية بروتينات إضافية إلى الشبكة. الجزء الأكثر أهمية من هذا البروتوكول هو اختيار كاشف الأجسام المضادة للمناعة. ويوصى لطخة الغربية أو Coomassie التحقق من الانتقائية قبل الانتهاء من هذا العمل.
يمكن أن يكون الدليل الداعم للتفاعلات البروتينية والبروتينية من النشاف الغربي المشترك للملكية الفكرية من المتفاعلين المحددين. البروتين الكيميائية عبر الربط ، على الرغم من أكثر تعقيدا ، يمكن أن تكشف عن مجالات التفاعل من interactors. باستخدام هذه الطريقة ، كشفت مجموعتي البحثية وظائف جديدة لDYRK1A ، وهو كيناز بروتيني مطلوب لتنمية الدماغ الثدييات ويرتبط بالأمراض العصبية لمرض الزهايمر.
