Этот рабочий процесс протеомики позволяет объективно идентифицировать и картировать эндогенные белково-белковые взаимодействия с субклеточным разрешением. Этот метод особенно выгоден при расследовании приманки белков, которые дозировка чувствительны, низкое изобилие, или имеют несколько субклеточных локализаций. Этот метод может быть применен к отображению эндогенных белковых взаимодействий при условии наличия подходящего реагента сродства.
Это особенно важно для многих из тысяч белков, которые имеют неизвестную функцию, многие из которых были связаны с болезнью человека. Этот метод может быть адаптирован к любой клеточной линии или ткани, подменяемой для субклеточной фракции. Любой белок с подходящим реагентом сродства может быть мишенью.
Общий результат для сродства экспериментов по очищению часто не является результатом. Действительно хорошие реагенты, сбор данных КК во всем, и ограничение обработки образцов все очень важны. Знайте, что у вас есть образец.
Для начала оттаивать подготовленные клеточные гранулы в течение 15 минут в 1X гранулы объем холодного буфера с ингибиторами протеазы или ингибиторы фосфатазы. Поместите трубку, содержащую гранулы клетки на nutator при четырех градусах по Цельсию, чтобы помочь в повторном получении в течение 30 минут. Затем поместите трубку в центрифугу при 2000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут, чтобы гранулы.
Декант supernatant и повторного перерасхода клеток с 5X упакованный объем ячейки с буфером A.Incubate на льду в течение 20 минут. Затем, гранулы снова на 2000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут. Decant буфера и resuspend с 2X оригинальный буфер объема упакованных клеток с ингибиторами протеазы или ингибиторы фосфатазы.
Dounce около семи раз с рыхлой пестик A.Centrifuge лисат в течение 10 минут при 2000 раз г и четыре градуса по Цельсию. Аккуратно перенесите супернатант в новую трубку и вспышки заморозьте его жидким азотом. Храните лисат при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
Повторное использование гранул с 0,9X гранулы объем буфера B с ингибиторами протеазы или ингибиторы фосфатазы и смешать на nutator в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию. Чтобы вынизыть ядра, dounce 20 раз с titer pestle B.Mix ядерного лизата на nutator в течение 30 минут при четырех градусах по Цельсию, так что это однородно. Затем центрифугировать ядерный лисат в течение 30 минут при 21 000 раз г при четырех градусах Цельсия.
Pipette от супернатанта и сохранить в качестве растворимого экстракта ядерного белка. Чтобы облизать растворимый ядерный экстракт, сначала вырежьте соответствующую длину 24 миллиметра шириной диализа трубки с восьмикилограммовым молекулярным разрезом веса. Зажимите одну сторону трубки и загрузите нуклеоплазму в трубу.
После загрузки лизата зажимите другой конец и погрузите в чистый стеклянный контейнер, содержащий буфер С с ингибиторами протеазы. Диализ в течение трех часов при четырех градусах по Цельсию. После этого перенесите диализу ядерного экстракта нуклеоплазмы в трубку и центрифугу при 21 000 раз г при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут.
Перенесите три 20 микролитровых алицитов ядерного экстракта в новые микроцентрифуговые трубки для проверки фракционации западным пятном. Используя пипетки советы, которые были сокращены на кончике, подготовить белок A / G шарик смеси для каждой репликации путем объединения 12,5 микролитера шарик объем белка Сефхароз с 12,5 микролитров белка G Sepharose в микроцентрифуг труб. Вымойте смесь шарика белка A/G два раза с помощью 300 микролитров буфера IP I.Spin шариков при 1500 г при четырех градусах По Цельсию в течение одной минуты и вылейте буфер.
Далее приготовьте антитела белка A/G бисера. Чтобы связать антитела к бисеру, добавьте в трубку 300 микролитров IP-буфера I и 10 микрограммов желаемого антитела. Разрешить бисер-антитела смеси рок на nutator при четырех градусах по Цельсию в одночасье.
Теперь aliquot соответствующие объемы ядерных лизайтов в низкой удержания микроцентрифуг трубки для одного миллиграмма белка входных на репликацию. Закрутите лизат 16 000 раз г в течение 30 минут и перенесите супернатант в новую трубку. Добавьте один микролитр бензоразы по 250 единиц на микролитр на каждый миллиграмм ядерного лизата и камень на нутриторе при четырех градусах Цельсия в течение 10-15 минут.
Для приготовления бисера для предварительной очистки лизата добавьте 12,5 микролитров каждого белка А и белка G бисера в 1,5 миллилитровых трубок с низким удержанием. Вымойте два раза с буфером мытья IP I с ингибиторами протеазы. Decant буфера и добавить один миллиграмм подготовленных ядерных лисировать на бисер.
Инкубировать во время качания на nutator в течение одного часа при четырех градусах по Цельсию. Центрифуга предварительно очищенных лизатов при 1500 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение одной минуты. Затем мыть антитела белка A или G шарики два раза с IP буфер i с ингибиторами протеазы.
После центрифугирования при 1500 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение одной минуты, decant буфера. Теперь перенесите предварительно очищенный ядерный лизат на антитела белка А или G шарики. Инкубировать во время качания на nutator при четырех градусах по Цельсию в течение четырех часов.
После инкубации центрифуга в 1500 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение одной минуты. Перенесите супернатант в трубки, помеченные как поток для каждой репликации. Вымойте белок антител A или G бисером четыре раза с одним миллилитром БУФЕРа IP II с ингибиторами протеазы.
Затем мыть бисер два раза с одним миллилитр IP буфера I с ингибиторами протеазы. Убедитесь, что все буферы удаляются после последней стирки. Elute белка от бисера путем инкубации с 20 микролитров 0,1 молярного глицина при рН 2,75 каждый в течение 30 минут на гайки.
Затем спина в 750 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение одной минуты и пипетки от супернатанта. Повторите эту инкубацию с буфером elution во второй раз. После приготовления белковой гранулы, повторно посовещение его с 30 микролитров буфера алкилирования SDS.
Инкубировать образец на 95 градусов по Цельсию тепловой блок в течение пяти минут. Затем дайте ему остыть при комнатной температуре в течение 15 минут. Добавьте в каждый образец 300 миллилитров раствора UA и 30 микролитров по 100 миллимоляров TCEP.
Загрузите раствор на центробежный фильтр 30K. После вращения центробежного фильтра при 21 000 г при комнатной температуре в течение 10 минут держите поток до конца в случае, если есть проблемы с фильтром. После мытья фильтра в соответствии с рукописью, добавьте три микролитера по одному микрограмму на микролитер lyse C, перерасходуемый в 0,1 молярных Трис рН 8,5.
Заполните фильтры до отметки 100 микролитров с 0,1 моляра Tris pH 8.5. Дайте ему переварить в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию во время качания на нутриторе. Далее добавьте один микролитер по одному микрограмму на микролитер MS класса трипсина.
Смешайте осторожно и дайте трипсину инкубировать с образцом на ночь при 37 градусах по Цельсию во время качания на nutator. Утром центрифуга несколько раз в 21 000 раз г в течение 20 минут, чтобы урезать пептиды из фильтра в чистую микроцентрифугную трубку с низким содержанием удержания. После опреснительной пептиды с помощью C18 спина колонки, повторно лиофилизированных пептидов в семи микролитров 0,1%TFA в 5%acetonitrile.
Sonicate образца в течение трех минут, чтобы убедиться, что пептиды были повторно, а затем спина вниз на 14000 раз г в течение 10 минут. Загрузите от 15 до 30% образца на систему масс-спектрометрии жидкой хроматографии для анализа. В этом исследовании были проанализированы трипликатные иммунопреципитации из пяти миллиграммов ядерного экстракта HeLa с использованием только бисерного контроля.
Приманка DYRK1A входит в тройку самых обогащенных белков по контролю, что указывает на надежность выполненного эксперимента IP-MS. Было показано четкое разделение между взаимодействиями высокой уверенности и более 95% копурифицированных белков были определены как неспецифические. В примере набора данных DYRK1A партнеры IREF представили значения FC-A как низкие до 0,45, что представляет собой очень низкое обогащение над контролем.
Соответственно, многие из этих ранее зарегистрированных взаимодействий являются ложными негативами в этом наборе данных, опадая ниже порога FC-A в три. Рассчитанное абсолютное число копий каждого взаимодействия IREF не показало никакой корреляции с уровнями обнаружения партнера по взаимодействию IP-MS. Комбинированное использование FC-A больше, чем три и святой больше, чем 0,9 сократили список высокой уверенности взаимодействующих до шести белков.
Однако при применении FC-A отсечения более трех в изоляции, восемь дополнительных белков были добавлены в сеть. Наиболее важной частью этого протокола является отбор реагента антител для иммунопреципиента. Западная помарка или Coomassie проверка селективности рекомендуется до завершения этого рабочего процесса.
Подтверждающие доказательства взаимодействия протеин-белка можно иметь от co-IP западного blotting определенных interactors. Белковые химические перекрестные связи, хотя и более сложные, могут выявить области взаимодействия взаимодействующих. Используя этот метод, моя исследовательская группа обнаружила новые функции для DYRK1A, протеиновой киназы, необходимой для развития мозга млекопитающих и связанной с невропатологией болезни Альцгеймера.
