Flux de spectrométrie de masse d'immunoprécipitation sans étiquette pour le profilage de l'interaction nucléaire à grande échelle

Ce flux de travail protéomique permet l’identification impartiale et la cartographie des interactions protéine-protéine endogène avec la résolution subcellulaire. Cette technique est particulièrement avantageuse lors de l’étude des protéines appâts sensibles au dosage, à faible abondance ou qui ont plusieurs localisations subcellulaires. Cette méthode pourrait être appliquée à la cartographie des interactions protéiques endogènes en supposant qu’il existe un réagencé d’affinité approprié disponible.

Ceci est particulièrement important pour bon nombre des milliers de protéines qui ont une fonction inconnue, dont beaucoup ont été liées à la maladie humaine. Cette méthode peut être adaptée à n’importe quelle lignée cellulaire ou tissu adapté à la fractionnement subcellulaire. Toute protéine ayant un reagent d’affinité approprié pourrait être ciblée.

Un résultat commun pour des expériences de purification d’affinité n’est souvent aucun résultat. Très bons reagents, la collecte de données QC partout, et la limitation de la manipulation de l’échantillon sont tous très importants. Sachez que vous avez un échantillon.

Pour commencer, décongeler les granulés cellulaires préparés pendant 15 minutes dans un volume de granulés 1X de tampon A froid avec des inhibiteurs de la protéase ou des inhibiteurs de la phosphatase. Placez le tube contenant la pastille cellulaire sur un nutator à quatre degrés Celsius pour faciliter la résuspension pendant 30 minutes. Ensuite, placez le tube dans une centrifugeuse à 2000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour pelleter.

Décanter le supernatant et resuspendre les cellules avec 5X le volume cellulaire emballé avec tampon A.Incubate sur la glace pendant 20 minutes. Ensuite, pelletez à nouveau à 2000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Décanter le tampon et résuspendre avec 2X tampon original volume cellulaire emballé A avec inhibiteurs de la protéase ou inhibiteurs de la phosphatase.

Dounce environ sept fois avec le pilon lâche A.Centrifugeuse le lysate pendant 10 minutes à 2000 fois g et quatre degrés Celsius. Transférer délicatement le supernatant dans un nouveau tube et le congeler avec de l’azote liquide. Conserver le lysate à moins 80 degrés Celsius.

Resuspendez la pastille avec un volume de granulés de 0,9 X de tampon B avec des inhibiteurs de la protéase ou des inhibiteurs de la phosphatase et mélangez sur un nutator pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Pour lyse les noyaux, dounce 20 fois avec le pilon de titer B.Mélanger le lysate nucléaire sur un nutator pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius afin qu’il soit homogène. Puis centrifugeuse le lysate nucléaire pendant 30 minutes à 21 000 fois g à quatre degrés Celsius.

Pipette sur le supernatant et enregistrer comme un extrait de protéine nucléaire soluble. Pour dialyser l’extrait nucléaire soluble, coupez d’abord une longueur appropriée de tube de dialyse de largeur de 24 millimètres avec une coupure moléculaire de poids de huit kilodalton. Serrez un côté du tube et chargez le nucléoplasme dans le tube.

Après le chargement du lysate, serrez l’autre extrémité et plongez dans un récipient en verre propre contenant le tampon C avec des inhibiteurs de protéase. Dialyz pendant trois heures à quatre degrés Celsius. Après cela, transférer le nucléoplasme d’extrait nucléaire dialysé dans un tube et une centrifugeuse à 21 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.

Transférer trois aliquots de 20 microlitres de l’extrait nucléaire vers de nouveaux tubes de microcentrifugeuse pour validation de fractionnement par tache occidentale. À l’aide de pointes de pipette qui ont été coupées à la pointe, préparer un mélange de perles protéiques A/G pour chaque réplique en combinant 12,5 microlitres de protéines A Sepharose avec 12,5 microlitres de protéine G Sepharose dans des tubes de microcentrifugeuse. Lavez le mélange de perles protéiques A/G deux fois avec 300 microlitres de tampon IP I.Spin les perles à 1500 fois g à quatre degrés Celsius pendant une minute et décanter le tampon.

Ensuite, préparez les perles a/g de protéine d’anticorps. Pour lier l’anticorps aux perles, ajouter au tube 300 microlitres de tampon IP I et 10 microgrammes de l’anticorps désiré. Laissez le mélange perle-anticorps se balancer sur un nutator à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Maintenant aliquot volumes appropriés des lysates nucléaires dans les tubes de microcentrifugeuse à faible rétention pour un milligramme d’entrée de protéines par réplique. Faites tourner le lysate à 16 000 fois g pendant 30 minutes et transférez le supernatant dans un nouveau tube. Ajouter un microlitre de Benzonase à 250 unités par microlitre pour chaque milligramme du lysate nucléaire et de la roche sur un nutator à quatre degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes.

Pour préparer les perles pour pré-compensation du lysate, ajouter 12,5 microlitres de chaque protéine A et protéines G perles à 1,5 millilitre tubes à faible rétention. Lavez-vous deux fois avec le tampon de lavage IP I avec des inhibiteurs de protéase. Décanter le tampon et ajouter un milligramme du lysate nucléaire préparé aux perles.

Incuber en se berçant sur un nutator pendant une heure à quatre degrés Celsius. Centrifugeuse les lysates pré-effacés à 1500 fois g et quatre degrés Celsius pendant une minute. Ensuite, lavez les perles d’anticorps protéine A ou G deux fois avec le tampon IP I avec des inhibiteurs de la protéase.

Après avoir centrifugé à 1500 fois g et quatre degrés Celsius pendant une minute, décanter le tampon. Maintenant, transférez le lysate nucléaire pré-autorisé sur les perles de protéine A ou G d’anticorps. Incuber en se berçant sur un nutator à quatre degrés Celsius pendant quatre heures.

Après l’incubation, centrifugeuse à 1500 fois g et quatre degrés Celsius pendant une minute. Transférer le supernatant dans des tubes étiquetés comme le flux à travers pour chaque réplique. Lavez les perles de protéine A ou G d’anticorps quatre fois avec un millilitre de tampon IP II avec des inhibiteurs de protéase.

Ensuite, lavez les perles deux fois avec un millilitre de tampon IP I avec des inhibiteurs de protéase. Assurez-vous que tous les tampons sont enlevés après le dernier lavage. Elute protéine sur les perles en couveant avec 20 microlitres de 0,1 glycine molaire au pH 2,75 chacun pendant 30 minutes sur un nutator.

Puis tourner à 750 fois g et quatre degrés Celsius pendant une minute et pipette hors du supernatant. Répétez cette incubation avec tampon d’élitution une deuxième fois. Après avoir préparé la pastille protéique, réutilisez-la avec 30 microlitres de tampon d’alkylation SDS.

Incuber l’échantillon sur un bloc thermique de 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Laisser refroidir à température ambiante pendant 15 minutes. Ajouter 300 millilitres de solution UA et 30 microlitres de TCEP de 100 millimlaires à chaque échantillon.

Chargez la solution sur un filtre centrifuge de 30 K. Après avoir fait tourner le filtre centrifuge à 21 000 fois g à température ambiante pendant 10 minutes, gardez le flux à travers au cas où il y ait un problème avec le filtre. Après avoir lavé le filtre selon le manuscrit, ajouter trois microlitres d’un microgramme par microlitre lyse C résuspendus en 0,1 molaire Tris pH 8,5.

Remplissez les filtres jusqu’à la marque de 100 microlitres avec 0,1 molaire Tris pH 8,5. Laissez-le digérer pendant une heure à 37 degrés Celsius tout en basculant sur un nutator. Ensuite, ajoutez un microlitre d’un microgramme par trypsine de qualité MS microliter.

Mélanger délicatement et laisser la trypsine couver avec l’échantillon pendant la nuit à 37 degrés Celsius tout en berçant sur un nutator. Le matin, centrifugeuse plusieurs fois à 21 000 g pendant 20 minutes pour éducher les peptides du filtre dans un tube de microcentrifugeuse propre à faible rétention. Après avoir desalcé les peptides à l’aide de colonnes de spin C18, résuspendez les peptides lyophilisés dans sept microlitres de 0,1% TFA en 5% d’acétylonitrile.

Sonicate l’échantillon pendant trois minutes pour s’assurer que les peptides ont été résuspendus, puis tourner vers le bas à 14.000 fois g pendant 10 minutes. Chargez 15 à 30 % de l’échantillon sur le système de spectrométrie de masse de chromatographie liquide pour analyse. Dans cette étude, des immunoprécippitations de triplicate ont été analysées de cinq milligrammes d’extrait nucléaire d’HeLa utilisant un contrôle perlé-seulement.

L’appât DYRK1A s’est classé parmi les trois principales protéines enrichies par rapport au contrôle qui indique que l’expérience IP-MS effectuée était fiable. Une séparation claire a été montrée entre les interacteurs de confiance élevée et plus de 95% des protéines copurifiées ont été identifiées comme non spécifiques. Par exemple, les partenaires d’interaction DYRK1A ont présenté des valeurs FC-A aussi faibles que 0,45 représentant un enrichissement très faible sur le contrôle.

Par conséquent, bon nombre de ces interactions précédemment signalées sont de faux négatifs dans cet ensemble de données en tombant en dessous du seuil FC-A de trois. Le nombre de copies absolues calculées de chaque interaction IREF n’a montré aucune corrélation avec les niveaux de détection d’un partenaire d’interaction par IP-MS. L’utilisation combinée de FC-A supérieure à trois et saint supérieure à 0,9 réduit la liste des interacteurs à haute confiance à six protéines.

Toutefois, lors de l’application d’un seuil FC-A de plus de trois dans l’isolement, huit protéines supplémentaires ont été ajoutées au réseau. La partie la plus cruciale de ce protocole est la sélection du réagrément d’anticorps pour l’immunoprécipitation. La validation de la sélectivité par la tache occidentale ou coomassie est recommandée avant d’achever ce flux de travail.

Des preuves à l’appui des interactions protéine-protéine peuvent être eues à partir du ballonnement occidental de co-IP des interacteurs identifiés. Les liaisons croisées chimiques protéiques, bien que plus complexes, peuvent révéler des domaines d’interaction d’interacteurs. En utilisant cette méthode, mon groupe de recherche a découvert de nouvelles fonctions pour DYRK1A, une kinase protéique nécessaire au développement du cerveau des mammifères et liée à la neuropathologie de la maladie d’Alzheimer.