이 프로테오믹스 워크플로우를 통해 세포외 분해능과 내인성 단백질-단백질 상호 작용의 편견없는 식별 및 매핑을 가능하게 합니다. 이 기술은 복용량에 민감한 미끼 단백질을 조사 할 때 특히 유리하다, 낮은 풍부, 또는 여러 세포 소세포 지역화가. 이 방법은 적합한 친화성 시약이 있다고 가정하여 내인성 단백질 상호 작용을 매핑하는 데 적용될 수 있습니다.
이것은 알 수 없는 기능을 가진 단백질의 수천의 많은 특히 중요합니다, 많은 인간 적인 질병과 연결 되었습니다. 이 방법은 세포외 분획에 적합한 임의의 세포주 또는 조직에 적응할 수 있다. 적당한 친화성 시약을 가진 모든 단백질은 표적으로 할 수 있었습니다.
선호도 정제 실험의 일반적인 결과는 종종 결과가 아닙니다. 정말 좋은 시약, 전체 QC 데이터를 수집, 샘플 처리를 제한하는 것은 모두 정말 중요합니다. 샘플이 있다는 것을 알 수 있습니다.
시작하려면, 프로테아제 억제제 또는 인산염 억제제로 차가운 완충제 A의 1X 펠릿 부피에서 15 분 동안 준비 된 세포 펠릿을 해동하십시오. 세포 펠릿이 들어 있는 튜브를 섭씨 4도에 영양사에 놓아 30분 동안 재서스펜션을 돕습니다. 그런 다음 튜브를 원심분리기에 2, 000배, 섭씨 4도에 넣고 펠릿까지 10분간 배치합니다.
상체를 데수제와 5배로 세포를 다시 일시 중지하여 20분 동안 얼음에 버퍼 A.Incubate를 장착하여 압축된 세포 부피를 재보아보시합니다. 다음으로, 펠릿은 다시 2, 000 배 g와 10 분 동안 섭씨 4도에서 다시. 프로테아제 억제제 또는 인산염 억제제로 버퍼를 억제하고 2X 원래 포장된 세포 부피 버퍼 A로 재연한다.
느슨한 유봉 A.원심분리기로 약 7회 2, 000배, 섭씨 4도에서 10분 동안 용해됩니다. 상체를 새 튜브로 조심스럽게 옮기고 액체 질소로 얼리십시오. 영하 80도에 보관하십시오.
프로테아제 억제제 또는 인산염 억제제로 완충 B의 0.9X 펠릿 부피로 펠릿을 다시 중단하고 4°C에서 5분간 누에이터에 섞는다. 핵을 lyse하려면, 티터 유봉 B.Mix와 함께 20 번 을 투하 B.Mix는 4섭씨에서 30 분 동안 영양사에 핵 용해를 혼합하여 균질성입니다. 그런 다음 원심 분리핵은 섭씨 4도에서 21, 000배 에서 30분 동안 30분 동안 용해됩니다.
상체에서 피펫과 수용성 핵 단백질 추출물로 저장합니다. 용해성 핵 추출물을 투석하기 위해 먼저 8킬로톤 분자량 차단으로 24mm 너비투석 튜브를 적절히 자른다. 튜브의 한쪽을 고정하고 핵을 튜브에 적재합니다.
용재를 로드한 후, 다른 쪽 끝을 고정하고 프로테아제 억제제로 버퍼 C를 함유한 깨끗한 유리 용기에 담급드한다. 섭씨 4도에서 3시간 동안 투석합니다. 그 후 투석된 핵 추출물을 튜브로 옮기고 원심분리기를 21, 섭씨 4도에서 000배 30분 동안 이송한다.
핵 추출물의 20개의 마이크로리터 알리쿼트 3개를 새로운 미세원심분리기 튜브로 이송하여 서부 블롯에 의한 분별 검증을 한다. 팁에서 절단 된 파이펫 팁을 사용하여, 마이크로 센티슈분리기 튜브에 단백질 G Sepharose의 12.5 마이크로 리터와 단백질 A Sepharose의 12.5 마이크로 리터를 결합하여 각 복제에 대한 단백질 A / G 비드 혼합물을 준비합니다. 단백질 A/G 비드 혼합물을 IP 버퍼 300 마이크로리터로 두 번 세척하여 구슬을 섭씨 4도에서 1, 500회 스핀하고 완충제를 절인다.
다음으로, 항체 단백질 A/G 구슬을 준비한다. 비드에 항체를 결합하려면, 튜브에 추가 300 IP 버퍼 I의 마이크로 리터 와 원하는 항체의 10 마이크로 그램. 비드 항체 혼합물이 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 영양사에 흔들도록 합니다.
이제 핵의 적절한 볼륨을 복제당 단백질 입력 1 밀리그램에 대해 낮은 보존 미세 센심 분리 튜브로 알리쿼트합니다. lysate를 16, 000회 g에서 30분 동안 회전시키고 상체를 새로운 튜브로 옮긴다. 10~15분 동안 4°C에서 4°C의 핵 라이세이트와 바위에 마이크로리터 당 250유닛에 벤조나아제 1마이크로리터를 넣습니다.
lysate를 미리 지우기 위한 구슬을 준비하려면 각 단백질 A및 단백질 G 비드1.5 밀리리터 저보유 튜브에 12.5 마이크로리터를 추가하십시오. 프로테아제 억제제로 IP 워시 버퍼 I로 두 번 씻습니다. 버퍼를 데수제하고 준비된 핵 리세이트의 1밀리그램을 구슬에 넣습니다.
섭씨 4도에서 1시간 동안 누에이터를 흔들면서 배양하십시오. 미리 지워진 용해는 1, 500배, 섭씨 4도에서 1분간 원심분리합니다. 그런 다음 프로테아제 억제제로 IP 버퍼 I로 항체 단백질 A 또는 G 비드를 두 번 세척합니다.
원심분리 후 1, 500배, 섭씨 4도에서 1분간 완충제를 절개합니다. 이제 미리 지워진 핵 용액을 항체 단백질 A 또는 G 구슬에 전달한다. 4 시간 동안 섭씨 4도에서 영양가를 흔들면서 배양하십시오.
인큐베이션에 이어 원심분리기는 1, 500배, 섭씨 4도에서 1분간. 상체를 각 복제에 대한 흐름으로 표시된 튜브로 전송합니다. 프로테아제 억제제로 IP 완충 II 1밀리리터로 항체 단백질 A 또는 G 비드를 4회 세척한다.
그런 다음 비드를 프로테아제 억제제로 IP 버퍼 I1 밀리리터로 두 번 씻습니다. 마지막 세척 후 모든 버퍼가 제거되었는지 확인합니다. 구슬에서 엘루트 단백질은 pH 2.75에서 0.1 개의 어금니 글리신 20 마이크로 리터를 영양사에서 30 분 동안 배양하여 구슬을 벗어 나.
그런 다음 750 배 g와 섭씨 4도에서 1 분 동안 회전하고 상체에서 파이펫을 피펫합니다. 용출 버퍼로 이 배큐어를 두 번째로 반복합니다. 단백질 펠릿을 준비한 후 SDS 알킬레이션 버퍼30 마이크로리터로 다시 중단하십시오.
샘플을 섭씨 95도 의 열 블록에 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 실온에서 15 분 동안 식힙니다. 각 샘플에 300밀리리터의 UA 솔루션과 100밀리머 TCEP30 마이크로리터를 추가합니다.
솔루션을 30K 원심 필터에 로드합니다. 원심 필터를 실온에서 21, 000배 에서 10분 간 회전한 후 필터에 문제가 있는 경우 흐름을 유지한다. 원고에 따라 필터를 세척 한 후, 마이크로 리터 리제 C 당 1 마이크로 그램의 3 마이크로 리터를 0.1 어금니 Tris pH 8.5로 재장 매재합니다.
필터를 0.1 어금니 Tris pH 8.5로 100 마이크로리터 마크까지 채웁니다. 영양가를 흔들면서 섭씨 37도에서 1 시간 동안 소화할 수 있습니다. 다음으로, 마이크로리터 MS 등급 트립신당 1마이크로그램의 마이크로리터를 추가합니다.
부드럽게 섞어서 트립신이 영양사에 흔들면서 하룻밤 사이에 샘플과 함께 배양할 수 있습니다. 아침에는 21회, 000배에서 여러 번 원심분리기를 사용하여 필터에서 펩티드를 깨끗한 낮은 보존 마이크로센티슈지 튜브로 엘로우게 한다. C18 스핀 컬럼을 사용하여 펩티드를 탈염한 후, 5%아세토닐릴에서 0.1%TFA의 7개의 마이크로리터에서 리오필화된 펩티드를 재분배한다.
펩티드가 다시 중단되었는지 확인하기 위해 샘플을 3분 동안 초음파 처리한 다음 10분 동안 14, 000배 g로 회전합니다. 분석을 위해 액체 크로마토그래피 질량 분광계 시스템에 샘플의 15~30%를 적재합니다. 이 연구에서는, 삼중면 면역 침전물은 구슬 전용 제어를 이용한 HeLa 핵 추출물의 5밀리그램으로부터 분석되었다.
미끼 DYRK1A는 수행된 IP-MS 실험이 신뢰할 수 있음을 나타내는 대조군을 통해 상위 3개의 농축 단백질 중 하나로 선정되었습니다. 높은 신뢰도 인터랙터와 95% 이상의 코퓨화된 단백질 사이에 명확한 분리가 비특이적으로 확인되었다. 예를 들어 DYRK1A 데이터 집합의 경우 IREF 상호 작용 파트너는 FC-A 값을 0.45로 표시하여 제어에 대한 매우 낮은 농축을 나타냅니다.
따라서 이전에 보고된 상호 작용 의 대부분은 FC-A 임계값 3 이하로 떨어짐으로써 이 데이터 집합 내에서 거짓 네거티브입니다. 각 IREF 상호 작용의 계산된 절대 복사 수는 IP-MS에 의한 상호 작용 파트너의 검출 수준과 상관관계가 없음을 보여 주었다. FC-A의 결합된 사용은 3개 이상 이고 성도가 0.9보다 큰 6개의 단백질로 높은 신뢰성 인터랙터의 목록을 감소시다.
그러나, 격리에서 3개 이상의 FC-A 컷오프를 적용할 때, 8개의 추가 단백질이 네트워크에 추가되었다. 이 프로토콜의 가장 중요한 부분은 면역 강수량을 위한 항체 시약의 선택입니다. 이 워크플로를 완료하기 전에 선택성의 웨스턴 블롯 또는 쿠마시 유효성 검사를 권장합니다.
단백질 단백질 상호 작용의 증거를 지원 하는 식별 된 interactors의 공동 IP 서쪽 blotting에서 있을 수 있습니다. 단백질 화학 적 상호 연결, 비록 더 복잡 하지만, 상호 작용 도메인을 공개할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여, 나의 연구 단은 DYRK1A를 위한 새로운 기능을, 포유류 두뇌 발달을 위해 요구되고 알츠하이머 병 신경 병리학과 연결한 단백질 키나아제를 발견했습니다.
