وكان الهدف الرئيسي لتطوير تقنية CSBN-MS الحصول على الوصول الشامل إلى تنظيم وتجميع مجمعات البروتين التي تكمن وراء تحويل الإشارة في وعبر غشاء البلازما لأنواع مختلفة من الأنسجة والأعضاء. يوفر csBN-MS حاليًا أعلى تنوع في الدقة لتحليل مركب البروتين الأصلي وتكوينها الفرعي، خاصة فيما يتعلق بالبروتينات الغشائية. على الرغم من أن تقنية CSBN-MS تم تطويرها لتحليل الخلائط المعقدة من مجمعات البروتين الغشائي في دماغ القوارض ، إلا أنه يمكن تكييفها بسهولة مع تحليل أي نوع من العينة البيولوجية.
واحدة من الخطوات الرئيسية لطريقتنا هو تضمين قطعة هلام ومحاذاة الصحيح إلى مستوى القطع قبل تقطيع. يجب الحرص على عدم المسيل للدموع أو لضغط هلام وتأكد من أنه لا يميل إلى الطائرة القطع لأن هذا من شأنه أن يقلل من قرار التحليل. لدينا تقنية CSBN-MS لديها العديد من الخطوات العملية التي تعتبر حاسمة لتحقيق نتائج جيدة.
من الأسهل إظهار كيفية تنفيذ هذه الخطوات بالتفصيل من مجرد وصفها. لبدء هذا الإجراء استخدام اثارة اثنين من غرفة خلاط التدرج التي يقودها مضخة ليلقي خطي أو جل التدرج المسامية الزائد. إعداد حلول لغرفة الخلط الأمامية وغرفة الخزان كما هو موضح في بروتوكول النص.
بدء تشغيل المُحرك وإضافة 30 ميكرولترات من وكالة الأنباء الجزائرية و 2.5 ميكرولترات من TEMED إلى الحل في الغرفة الأمامية. ثم، بدء المضخة وفتح صمام الجبهة. بعد ما يقرب من دقيقة واحدة، إضافة 90 ميكرولترات من وكالة الأنباء الجزائرية وخمسة microliters من TEMED إلى غرفة الخزان وفتح اتصال الغرفة.
السماح للجل البلمرة ببطء ودقة لمدة 24 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة لتوليد التدرج حجم المسام متجانسة. إذا أبقى رطبة هلام بلمرة يمكن تخزينها تستقيم في أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. المقبل، وإعداد فتحات التحميل عن طريق إدراج المسافات المناسبة بين لوحات الزجاج لفصل بين 0.5 و 2.0 ملليغرام من البروتين.
يجب أن يكون عرض الفتحات ثلاثة سنتيمترات على الأقل. لتشغيل المخازن المؤقتة، وإعداد العازلة الكاثود الدائمة التي تتكون من 50 ميليمولار tricine، 50 ملليمولار بيس تريس، و 0.01٪ Coomassie G-250. إعداد العازلة الأنود القياسية التي تتكون من 50 ميليمولار بيس تريس.
Solubilize ما يقرب من 2.5 ملليغرام من الغشاء واثنين من ملليلتر من العازلة solubilization تحتوي على 1 ٪ غير denaturing المنظفات على الجليد لمدة 30 دقيقة. ثم فائقة الrifuge في 130، 000 مرات G لمدة 11 دقيقة. تركيز solubilisate على 50٪ 20٪ خطوة sucrose متدرجة من قبل الrifugation فائقة في 400، 000 مرات G لمدة ساعة واحدة.
بعد هذا، حصاد التدرج السكروز من الجزء السفلي من الأنبوب، إضافة 0.05٪ Coomassie G-250 إلى solubilisate، وتحميل العينة على هلام. تشغيل BN-PAGE إعداد في 10 درجة مئوية بين عشية وضحاها باستخدام بروتوكول الجهد ثلاث خطوات، كما هو مبين في بروتوكول النص. بعد أن يتم تشغيل الجل مسح المواد الهلامية لأغراض التوثيق مع الاحتفاظ بها بين لوحات الزجاج.
فحص نوعية فصل هلام. بعد ذلك ، dissemble لوحات ومكوس المقاطع حارة من الفائدة. إصلاح الممرات مرتين مع 30٪ الإيثانول و 15٪ حمض الخليك لمدة 30 دقيقة على الأقل.
نقل عينة من التضمين المتوسطة والسماح لها لنقع وتككيل لمدة ساعتين على الأقل مع الحفاظ على لوح هلام في حركة بطيئة على شاكر المدارية. ثم، قطع الممرات هلام ثابت في أقسام موازية تماما لواجهة هجرة البروتين، أو نمط الفرقة. ضع كل قسم على دعم فيلم بلاستيكي بأبعاد متساوية من أجل التعامل معه بسهولة.
نقل الممرات إلى أنبوب مفتوح مع سدادات مغلقة في الجزء السفلي ومثقبة مركزيا على الجزء العلوي، وكلاهما الانحياز بدقة مع الطرفين العلوي والسفلي من قسم هلام. تراجع اسطوانة في النيتروجين السائل لفترة وجيزة لبدء بسرعة التصلب. يقوي متوسط التضمين الشفاف في غضون ثوان ويصبح أبيض اللون.
ملء تجويف مع تضمين المتوسطة، تراجع لفترة وجيزة الاسطوانة في النيتروجين السائل، ومن ثم السماح لها تجميد جيدا في ناقص 20 درجة مئوية لعدة ساعات. بعد التفكيك، قم بإزالة الفيلم البلاستيكي ونقل الكتلة مع قسم الجل المدمج إلى أسطوانة معدنية مبردة. الاسطوانة أكبر قطر ومختومة في الخارج مع التضمين المتوسط.
يتم وضعه على دعم مسطح. ملء الاسطوانة مع تضمين المتوسطة وتجميد تماما كما ذكر من قبل. كرر هذا الإجراء مع الجانب الآخر من الاسطوانة للحصول على كتلة صلبة مع سطح القاع االقطار.
ثم، إزالة كتلة من الاسطوانة واستخدام تضمين المتوسطة للصقه إلى حامل معدني ما قبل التبريد. أدخل حامل المعدن في آلة التبريد. حامل يجب أن يكون محاذاة بعناية فيما يتعلق الطائرة تقطيع.
السماح للكتلة لتكواز إلى درجة الحرارة المثلى لعملية تشريح. بعد هذا الحصاد شرائح هلام واحدا تلو الآخر مع سمك المطلوب النهائي من 0.25 ملليمتر حجم الخطوة ونقلها بشكل فردي إلى أنابيب رد فعل مع خصائص منخفضة البروتين ملزمة. ثم، يتم إخضاع الشرائح إلى هضم مُلَكِم وتحليل مطياف الكتلة.
ويوسع هذا البروتوكول نطاق تطبيق التنميط المعقد العالي الدقة ليشمل الأغشية غير الميتوكوندريا التي تعبر عن البروتينات المنخفضة الوفرة. الفصل المعقد يظهر عصابات البروتين الملون بقوة مع القليل جدا من القطع الأثرية الهجرة. تشير انحرافات إشارات الببتيد في الكتلة ووقت الاحتفاظ إلى معدل منخفض للغاية لتعيين حجم الذروة الموجبة الكاذبة.
يتم التخلص بسهولة من الاختلافات التشغيل لتشغيل عن طريق إعادة تحديد مجموعات بيانات حجم الذروة. ثم يتم استخدام معلومات كثافة الببتيد الناتجة لإعادة بناء 2545 ملامح البروتين من وفرة نسبية. تم تقييم أهمية حجم خطوة أخذ عينات الهلامية في حل مجمعات البروتين من خلال الانضمام إلى مجموعات البيانات من الشرائح المجاورة.
في 0.25 ملليمتر، حجم فصل من السكان المعقدة TPC1 المرتبطة بشكل جيد في الاتفاق مع نتائج تحليل البقع الغربية. الانضمام لأكثر من شريحتين يلغي التمييز في الـ TPC1 السكان الفرعيين المركبين. وأخيراً، يقدم التحليل معلومات عن المجمعات ذات الميز الجيد ويبين وجود وحدات فرعية جديدة وجمعيات معقدة.
بالنسبة للفيريتين، تشير ملفات تعريف الوحدات الفرعية المعدلة لوفرتها النسبية إلى وجود ثلاثة أشكال متساوية معقدة على الأقل مع سلسلة ثقيلة /خفيفة متميزة. وعلى النقيض من ذلك، تظهر مجمعات nicalin-nomo1، ومجمع ناما-سيكرياز الأساسي، وآلات GPI-transamidase نسب وفرة ثابتة من وحداتها الفرعية الأساسية على نطاق الحجم الكامل ومستقلة عن الارتباط مع بروتينات إضافية. المعلمة الرئيسية لتحليل csBN-MS هي الدقة الفعالة للمجمعات ، والتي يتم تحديدها من خلال الكيمياء الحيوية عينة ، جودة هلام BN ، المحاذاة السليمة أثناء التضمين وتقطيع ، ونوعية البيانات MS المكتسبة.
وتمشيط csBN-MS مع وضع العلامات النظيرية للبروتينات والعينات سيسمح بإجراء مقارنة مباشرة بين المجمعات في مختلف الحالات الفيزيولوجية أو البيولوجية أو التنموية. كشف csBN-MS على الأغشية من دماغ القوارض التنوع الهائل للمستقبلات والقنوات الأيونية والناقلات فيما يتعلق بتكوين الوحدة الفرعية ووظيفتها ، وسيكون ذلك مفيدًا لتحليل الهيكل ثلاثي الأبعاد في الاستعدادات الأصلية.
