استخدام البروتوكول كـ تأثير بيوفيزيائي للمحركات البصرية المختلفة على نشاط عضلة القلب يمكن اختبارها للمساعدة في تطوير التجارب البصرية في الأنسجة القلبية وقلوب كاملة. من خلال الجمع بين تقنية المشبك التصحيح مع تتبع الساروموير والألياف الكربونية بمساعدة قياسات القوة، يمكننا دراسة آثار التنشيط الضوئي GtACR1 على الكهرباء والميكانيكا من القلب البطيني. يمكن استخدام تثبيط Optogenetic للرجفان البصري.
GtACR1 هو أداة optogenetic التي تمكن من إسكات نشاط القلب. هذه التقنية قابلة للتطبيق تماما على مجالات البحث الأخرى مثل دراسات الخلايا العضلية على نحو سلس وخلية واحدة. على الرغم من أن هذا البروتوكول لا يمكن استخدامه لفحص الإنتاجية العالية، فإنه يوفر وسيلة للتحليل الشامل لوظيفة القلب والميكانيكية.
لذا كما يقول المثل، تقول الصورة أكثر من ألف كلمة. ما هي المعلومات التي يمكننا الحصول عليها في الفيديو؟ بعض أدواتنا وتقنيات المشاركة في تمدد myocyte واحد وفي إعداد التحقيق معقدة للغاية وأنه من الأسهل بكثير لنقلها في شريط فيديو بالمقارنة مع وصف.
بعد أن تم غسل الدم من القلب الملحي من أرنب أبيض نيوزيلندي يبلغ من العمر تسعة إلى 10 أسابيع ، قم بتبديل البيرفوسات إلى محلول منخفض الكالسيوم وعالي البوتاسيوم وضخ القلب لمدة دقيقتين ا فقط بعد توقف القلب عن النبض. قم بضخ محلول الإنزيم، ابدأ في إعادة تدوير محلول الإنزيم إلى الخزان بعد دقيقتين من الهضم، وانقل السرعة إلى 16 ملليلتر في الدقيقة بعد خمس دقائق من الهضم. مرة واحدة في الأنسجة يبدو لينة بعد 40-50 دقيقة من الهضم، وقطع القلب قبالة قنية ووضع القلب على الفور في منع الحل.
إضافة حل حجب حتى يتم تغطية الأنسجة بالكامل. قطع البطين الأيمن و الحاجز وفصل البطين الأيسر. إزالة عضلات الحليمة واستخدام ملقط غرامة وماصة لسحب بلطف بعيدا الأنسجة لاطلاق سراح الخلايا عن طريق التفكك الميكانيكية.
تصفية تعليق الخلية من خلال شبكة مع واحد ملليمتر التربيعي المسام والرواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي. ثم resuspend بيليه cardiomyocyte في حل منع جديدة. لتجربة المشبك التصحيح، معطف autoclaved يغطي في طبق بيتري مع 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من اللامينيين مباشرة قبل ثقافة الخلية.
لتجربة ألياف الكربون، معطف أطباق بيتري مع 0.12 غرام لكل ملليلتر من بولي هيما في محلول الإيثانول إلى الماء 95-5. عشر إلى 15 دقيقة بعد إعادة تعليق عضلة القلب، وإزالة supernatant وإعادة تعليق الخلايا في المتوسطة الثقافة. بعد العد، بذور الخلايا على غطاء في طبق بيتري في كثافة الهدف من 1.75 مرات 10 إلى الخلايا الأربع لكل ملليلتر.
احتضان الثقافات لمدة ثلاث إلى أربع ساعات في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في نهاية الحضانة، استبدال المتوسطة من الثقافات غطاء مع المتوسطة الطازجة التي تحتوي على الفيروس الغدي نوع خمسة الترميز لGACR1-eGFP في تعدد العدوى من 75. إعادة الثقافات إلى الحاضنة لمدة 48 ساعة.
لتنفيذ تجربة المشبك التصحيح، واستخدام سحب micropipette لسحب 1.7 إلى 2.5 ميغاوم الماصات التصحيح من الصودا الشعيرات الزجاجية الجير و تهيئة البرمجيات الحصول على البيانات. ضع غطاء مع خلايا في غرفة القياس التي تحتوي على حل خارجي وحدد عضلة القلب على أساس الفلورس eGFP الخاص به. بعد ذلك، تعبئة ماصة التصحيح مع المحلول الداخلي وإرفاق ماصة إلى حامل ماصة إدراج الفضة كلوريد المغلفة الفضة تسجيل سلك في الحل الداخلي.
قم بتعيين اختبار الغشاء لتطبيق نبضات 10 ملليفولت لمدة 15 مللي ثانية مع خط أساس من صفر ملليفولت. بعد الوصول إلى التكوين المرفقة بالخلايا، قم بالتبديل إلى وضع الخلية بالكامل مع إمكانية حمل 60 ملليفولت ناقص في برنامج الحصول على البيانات. ثم تطبيق بلطف الضغط السلبي للوصول إلى تكوين الخلية بأكملها عن طريق تمزق الغشاء.
وسوف يتضح التمزق الناجح من خلال زيادة فورية في السعة المقاسة. سجل بروتوكولات التنشيط الضوئي في وضع المشبك الجهد في ناقص 74 millivolts مع نبضات الضوء من 300 ميلي ثانية أو إمكانات العمل في وضع المشبك الحالي في picoampere صفر. لإنتاج ألياف الكربون، قم أولاً بتركيب الماصة على أصحاب الماصات من السحب.
سحب الشعيرات الزجاجية إلى اثنين من الماصات مع طول مدبب إجمالي حوالي 11 ملليمتر وقطر داخلي نهائي من حوالي 30 ميكرومتر. بعد ذلك، استخدم مجهر ستيريو لمحاذاة شعري واحد في دائرة التوجيه وانحني بواسطة ما يصل إلى 45 درجة عن طريق الضغط لأسفل على طرف الشعيرات الدموية مع بندر. تسخين خيوط حتى يحافظ شعري على زاوية 45 درجة حتى بعد إزالة بندر.
بعد الانحناء الشعرية، واستخدام ملقط غرامة مجهزة أنابيب لينة لإخراج واحد من ألياف الكربون من الأنبوب وتناسبها في طرف ناعم من شعري. دفع الألياف في الشعرية حتى الانحناء. قطع ألياف الكربون بحيث يقومون بتوقع مليلترين من طرف الشعيرات الدموية واستخدام الغراء سيانواكريلات لإصلاح الألياف إلى القسم الأمامي من كل شعري.
لمعايرة الألياف، إرفاق واحد الشعرية إلى حامل تسيطر عليها ميكرومانبيلاتور ومحرك بيزو. حرك الشعيرات الدموية نحو المستشعر ومحاذاته بالنسبة إلى المستشعر. ضع طرف الألياف في اتصال مع مستشعر القوة دون إنتاج أي قوة.
الحركة الإجمالية لمحرك بيزو هو 60 ميكرومتر. حرك محرك بيزو في ست خطوات 10 ميكرومتر نحو مستشعر القوة. جهاز استشعار لديه حساسية من 0.05 millinewtons لكل فولت وقوة تتراوح من صفر إلى 0.5 millinewtons.
قراءة الجهد قياس لكل خطوة وإزالة ألياف الكربون من أجهزة الاستشعار. لتسجيل قوة التعاقد cardiomyocytes، معطف سطح غطاء مع بولي-هيما ووضعها في غرفة القياس. ملء الغرفة مع حل حمام خارجي.
نعلق كلا من ألياف الكربون محملة الشعيرات الدموية إلى مرحلة micromanipulator ومحاذاة لهم في زاوية بحيث تكون ألياف الكربون بالقرب من الأفقي إلى سطح غرفة القياس. للتحقق مما إذا كانت الألياف محاذية بشكل صحيح، ركز على سطح غرفة القياس، اخفض الألياف الأولى، وتحريك الألياف أفقيًا. يجب أن ينزلق طرف الألياف على سطح غرفة القياس.
اتبع نفس الإجراء للألياف الثانية. مع إطفاء الأنوار، أضف بضع قطرات من تعليق الخلايا المستزرعة إلى الغرفة وقم بتطبيق نبضات الضوء الأخضر القصيرة لتحديد الخلايا التي تتقلص استجابة لتحفيز الضوء الأخضر. لإرفاق الألياف الأولى، ضغط بلطف الخلية عن طريق خفض الألياف ثم الافراج عن الضغط.
إرفاق الألياف الثانية موازية لأول واحد في الطرف الآخر من عضلة القلب من أجل الحصول على أكبر عدد ممكن من الساركوميريات بين الألياف اثنين. بعد توصيل كل من الألياف، ورفع الألياف بحيث لم تعد الخلية في اتصال مع سطح الغرفة. جلب ساركوميريس في التركيز، تعيين نافذة تتبع طول الساركومير بين الألياف، واستخدام وحدة الكشف عن الحافة لتتبع الانحناء الألياف.
تعيين مناطق الكشف مع النوافذ الحمراء والأخضر وتحديد عتبة في المشتقة الأولى من أثر كثافة الضوء. بصريا وتيرة الخلية في حين تتبع طول الساركومير والألياف الانحناء. في هذه الحالة، نحن يسير في 0.25 هيرتز.
بعد تسجيل ما لا يقل عن 15 تقلصات أثار بصريا، الحقل تحفيز الخلية كهربائيا. أوجد العتبة اللازمة لإثارة الانقباضات وتطبيق 1.5 مرة على مستوى الحد الأدنى من الجهد لطية التيار الكهربائي. لبروتوكول تثبيط، وتطبيق المحفزات الكهربائية لإثارة تقلصات ومن ثم تعريض الخلية لنبض الضوء المستمر في شدة الضوء المختلفة.
سجل ما لا يقل عن 15 تقلصات بعد تثبيط الناجم عن الضوء. يتم التعبير عن GtACR1 في الأرانب المُزَوَلِة. ينتج عن التنشيط الضوئي GtACR1 بكثافة ضوء تبلغ أربعة ملليوات لكل ملليمتر مربع لمدة 300 مللي ثانية تيارات كبيرة موجهة نحو الداخل عند 74 ملليفولت ناقص مع تيار ذروة محسوب يبلغ 245 بيكوampere.
في هذه التجربة التمثيلية، تم تشغيل إمكانات العمل إما كهربائيا مع الحقن الحالية 1.5 مرة العتبة أو بصريا مع نبضات الضوء 10 مللي ثانية. أظهرت cardiomyocytes يسير بخطى بصريا أبطأ العمل المحتملة بداية. تم تثبيط إمكانات العمل التي تم تشغيلها كهربائيًا تحت ضوء مستمر.
الحقن الحالية أعلى و 1.5 مرات عتبة خلال تطبيق الضوء المستمر أيضا لا تثير إمكانات العمل. ولدت cardiomyocyte قوة انكماش من 232 ميكرون لكل ملليمتر مربع على سرعة الكهربائية و 261 ميكرون لكل ملليمتر مربع بعد سرعة البصرية. نبضات الضوء الأخضر المطولة منعت الانقباضات مع الانقباضات التي تتكرر بعد التثبيط مما يولد قوة انقباضية أقل بما يتماشى مع فقدان الكالسيوم الانبساطي من الأرانب القلبية.
نوصي بممارسة التقنيات قبل إجراء تجربة، لا سيما أن تحديد المواقع المجهرية في الظلام يمكن أن يكون تحديا. مهم جدا عند تحليل cardiomyocyte انكماش كما أنه يمكن أن تؤثر على قوة الإنتاج والاسترخاء. ويمكن أيضا أن تطبق حمولات مختلفة لتحليل انكماش متساوي التوتر و auxotonic.
هذه التقنيات تسمح توصيف الآثار الفيزيائية الحيوية لتنشيط المحركات البصرية المطورة حديثا في cardiomyocytes وهو أمر حاسم لاختيار أنسب أداة optogenetic لكل تجربة. يرجى الانتباه إلى أن عملية نقل الفيروس الغدي وجميع الخطوات التالية للانهاك ينبغي أن تتم في ظل ظروف السلامة البيولوجية II.
