L’utilisation du protocole comme effet biophysique de différents actionneurs optogénétiques sur l’activité des cardiomyocytes peut être testée pour faciliter le développement d’expériences optogénétiques dans les tissus cardiaques et les cœurs entiers. En combinant la technique de pince de correction avec le suivi de sarcomere et les mesures assistées de force de fibre de carbone, nous pouvons étudier les effets de la photoactivation gtACR1 sur l’électricité et la mécanique des cardiomyocytes ventriculaires. L’inhibition optogénétique peut potentiellement être utilisée pour la défibrillation optique.
GtACR1 est un outil optogénétique qui permet le silencing de l’activité cardiaque. Cette technique s’applique entièrement à d’autres domaines de recherche tels que les études sur les cellules musculaires lisses et unicell cellules. Bien que ce protocole ne puisse pas être utilisé pour le criblage à haut débit, il fournit un moyen pour l’analyse complète de la fonction électrique et mécanique des cardiomyocytes.
Ainsi, comme le dit l’adage, une image dit plus de mille mots. Combien d’informations pouvons-nous obtenir en vidéo? Certains de nos outils et techniques impliqués dans l’étirement unique des myocytes et dans la préparation des sondes sont très complexes et il est beaucoup plus facile de les transmettre dans une vidéo par rapport à une description.
Après que le sang a été lavé hors du coeur perfusé salin d’un lapin blanc néo-zélandais de neuf à dix semaines, changez le perfusate à une solution à faible teneur en calcium et à haute teneur en potassium et imprènuez le cœur pendant deux minutes de plus après que le cœur cesse de battre. Perfuser la solution enzymatique, commencer à recirculer la solution enzymatique dans le réservoir après deux minutes de digestion, et diminuer la vitesse à 16 millilitres par minute après cinq minutes de digestion. Une fois que le tissu semble mou après 40-50 minutes de digestion, couper le cœur de la canule et placer immédiatement le cœur dans la solution de blocage.
Ajouter la solution de blocage jusqu’à ce que le tissu soit entièrement couvert. Couper le ventricule droit et le septum et séparer le ventricule gauche. Enlevez les muscles papillaires et utilisez des forceps fins et une pipette pour démonter doucement le tissu pour libérer les cellules par dissociation mécanique.
Filtrer la suspension cellulaire à travers un maillage avec des pores carrés d’un millimètre et sédimenter les cellules par centrifugation. Puis résuspendez la pastille cardiomyocyte dans la solution de blocage frais. Pour une expérience de pince à patch, enduire les coverslips autoclavés dans une boîte de Petri de 100 microgrammes par millilitre de laminine immédiatement avant la culture cellulaire.
Pour l’expérience en fibre de carbone, enduire les boîtes de Petri de 0,12 gramme par millilitre de Poly-HEMA dans une solution éthanol-eau de 95 à 5. Dix à 15 minutes après avoir réutilisé les cardiomyocytes, enlever le supernatant et résuspendre les cellules dans le milieu de la culture. Après comptage, ensemencer les cellules sur un coverslip dans une boîte de Petri à une densité cible de 1,75 fois 10 à quatre cellules par millilitre.
Incuber les cultures pendant trois à quatre heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. À la fin de l’incubation, remplacer le milieu des cultures de coverslip par un milieu frais contenant du codage de type adénovirus cinq pour gtacr1-eGFP à une multiplicité d’infection de 75. Retourner les cultures à l’incubateur pendant 48 heures.
Pour effectuer une expérience de pince à patch, utilisez un puller micropipette pour tirer 1,7 à 2,5 mégaohm pipettes patch de capillaires en verre de chaux de soude et de para paranaliser le logiciel d’acquisition de données. Placez un coverslip avec des cellules dans la chambre de mesure contenant la solution externe et sélectionnez le cardiomyocyte basé sur sa fluorescence eGFP. Ensuite, remplissez une pipette patch avec une solution interne et fixez la pipette au support pipette insérant le fil d’enregistrement en argent recouvert de chlorure d’argent dans la solution interne.
Réglez le test membranaire pour appliquer des impulsions de 10 millivolts pendant 15 millisecondes avec une ligne de base de zéro millivolts. Après avoir atteint la configuration fixée à la cellule, passez en mode cellulaire entier avec un potentiel de détention de moins 60 millivolts dans le logiciel d’acquisition de données. Ensuite, appliquez doucement une pression négative pour accéder à toute la configuration cellulaire en rupturing de la membrane.
Une rupture réussie sera démontrée par une augmentation immédiate de la capacité mesurée. Enregistrez les protocoles de photoactivation en mode pince de tension à moins 74 millivolts avec des impulsions lumineuses de 300 millisecondes ou des potentiels d’action en mode pince actuel à zéro picoampere. Pour produire les fibres de carbone, montez d’abord la pipette sur les porte-pipette du puller.
Tirez les capillaires en verre dans deux pipettes d’une longueur totale effilée d’environ 11 millimètres et d’un diamètre intérieur final d’environ 30 micromètres. Ensuite, utilisez un microscope stéréo pour aligner un capillaire dans le cercle d’orientation et le plier jusqu’à 45 degrés en poussant vers le bas sur la pointe du capillaire avec une cintreuse. Chauffer le filament jusqu’à ce que le capillaire maintienne l’angle de 45 degrés même après l’enlever.
Après avoir plié le capillaire, utilisez des forceps fins équipés de tubes souples pour sortir une fibre de carbone du tube et l’insérer dans la pointe fine du capillaire. Poussez la fibre dans le capillaire jusqu’au virage. Coupez les fibres de carbone afin qu’elles projettent deux millilitres de la pointe du capillaire et utilisent de la colle cyanoacrylate pour fixer les fibres à la partie avant de chaque capillaire.
Pour calibrer les fibres, fixez un capillaire à un support contrôlé par un micromanipulateur et un moteur piezo. Déplacez le capillaire vers le capteur et alignez-le par rapport au capteur. Placez la pointe de la fibre en contact avec le capteur de force sans produire de force.
Le mouvement total du moteur piezo est de 60 micromètres. Déplacez le moteur piezo en six pas de 10 micromètres vers le capteur de force. Le capteur a une sensibilité de 0,05 millinewtons par volt et une plage de force de zéro à 0,5 millinewtons.
Lisez la tension mesurée pour chaque étape et retirez la fibre de carbone du capteur. Pour enregistrer la force des cardiomyocytes contractants, enduire la surface d’un verre de couverture de Poly-HEMA et la placer dans la chambre de mesure. Remplissez la chambre d’une solution de bain externe.
Fixez les deux capillaires chargés de fibre de carbone au micromanipulateur de scène et alignez-les à un angle de sorte que les fibres de carbone soient près horizontales à la surface de la chambre de mesure. Pour vérifier si les fibres sont correctement alignées, concentrez-vous sur la surface de la chambre de mesure, abaissez la première fibre et déplacez la fibre horizontalement. La pointe de la fibre doit glisser sur la surface de la chambre de mesure.
Suivez la même procédure pour la deuxième fibre. Avec les lumières éteintes, ajouter quelques gouttes de suspension cellulaire de culture à la chambre et appliquer des impulsions de lumière verte courte pour sélectionner les cellules qui se contractent en réponse à la stimulation de la lumière verte. Pour attacher la première fibre, compressez doucement la cellule en abaissant la fibre puis relâchez la pression.
Fixez la deuxième fibre parallèle à la première à l’autre extrémité du cardiomyocyte afin d’avoir un nombre maximum de sarcomeres entre les deux fibres. Une fois les deux fibres attachées, soulevez les fibres de sorte que la cellule ne soit plus en contact avec la surface de la chambre. Mettez les sarcomes au point, réglez la fenêtre de suivi de la longueur du sarcomère entre les fibres et utilisez le module de détection des bords pour suivre la flexion de la fibre.
Définissez les zones de détection avec les fenêtres rouges et vertes et définissez un seuil au premier dérivé de la trace d’intensité lumineuse. Rythme optique de la cellule tout en suivant la longueur du sarcome et la flexion des fibres. Dans ce cas, nous avons suivi à 0,25 hertz.
Après avoir enregistré au moins 15 contractions optiquement obtenues, le champ stimule la cellule électriquement. Trouvez le seuil pour obtenir les contractions et appliquez 1,5 fois la tension seuil pour le rythme électrique. Pour un protocole d’inhibition, appliquer des stimuli électriques pour provoquer des contractions, puis exposer la cellule à une impulsion lumineuse soutenue à diverses intensités lumineuses.
Enregistrez au moins 15 contractions après une inhibition induite par la lumière. GtACR1 s’exprime dans les cardiomyocytes de lapin cultivés. La photoactivation gtACR1 à une intensité lumineuse de quatre milliwatts par millimètre au carré pendant 300 millisecondes entraîne de grands courants dirigés vers l’intérieur à moins 74 millivolts avec un courant de pointe mesuré de 245 picoampere.
Dans cette expérience représentative, les potentiels d’action ont été déclenchés soit électriquement avec des injections actuelles 1,5 fois le seuil ou optiquement avec des impulsions lumineuses de 10 millisecondes. Les cardiomyocytes optiquement rythmés ont démontré un début potentiel d’action plus lent. Des potentiels d’action électriquement déclenchés ont été inhibés sous la lumière soutenue.
Des injections actuelles plus élevées et 1,5 fois le seuil pendant l’application de lumière soutenue ne suscitent pas non plus de potentiels d’action. Le cardiomyocyte a généré une force de contraction de 232 micronewtons par millimètre au carré sur le rythme électrique et de 261 micronewtons par millimètre au carré suivant le rythme optique. Les impulsions prolongées de lumière verte ont empêché les contractions avec les contractions post-inhibition se recréant générant une force contractile inférieure en accord avec la perte diastolique de calcium des cardiomyocytes de lapin.
Nous recommandons de pratiquer les techniques avant de mener une expérience, d’autant plus que le positionnement des microprobes dans l’obscurité peut être difficile. est très important lors de l’analyse de la contractilité des cardiomyocytes car elle peut affecter la production de force et la relaxation. Divers afterloads peuvent également être appliqués pour l’analyse isotonique et auxotonique de contraction.
Ces techniques permettent de caractériser les effets biophysiques de l’activation d’actionneurs optogénétiques nouvellement développés dans les cardiomyocytes, ce qui est crucial pour choisir l’outil optogénétique le plus approprié pour chaque expérience. Veuillez noter que la transduction de l’adénovirus et toutes les étapes suivant la transduction doivent être effectuées dans des conditions de biosécurité de niveau II.
