Protokolün kardiyomiyosit aktivitesi üzerine farklı optogenetik aktüatörlerin biyofiziksel etkisi olarak kullanılması, kardiyak doku ve tüm kalplerde optogenetik deneylerin geliştirilmesine yardımcı olmak için test edilebilir. Yama kelepçesi tekniğini sarcomere izleme ve karbon fiber destekli kuvvet ölçümleri ile birleştirerek GtACR1 fotoaktivasyonunun ventriküler kardiyomiyositlerin elektrik ve mekaniği üzerindeki etkilerini inceleyebiliriz. Optogenetik inhibisyon optik defibrilasyon için potansiyel olarak kullanılabilir.
GTACR1 kardiyak aktivitenin susturulmasını sağlayan optogenetik bir araçtır. Bu teknik tamamen düz ve tek hücreli kas hücresi çalışmaları gibi diğer araştırma alanları için geçerlidir. Bu protokol yüksek iş elde tarama için kullanılamasa da, kardiyomiyosit elektrik selve mekanik fonksiyonunun kapsamlı analizi için bir araç sağlar.
Yani deyiş gider, bir resim binden fazla kelime söylüyor. Videoda daha ne kadar bilgi edinebiliriz? Bazı araç ve teknikleri tek miyosit germe dahil ve prob hazırlanması son derece karmaşık ve bir açıklama ile karşılaştırıldığında bir video bunları iletmek için çok daha kolaydır.
9 ila 10 haftalık Yeni Zelanda beyaz tavşanından tuzlu perfüzyon kalpten kan çıkarıldıktan sonra, perfusate'yi düşük kalsiyumlu, yüksek potasyumlu solüsyonuna çevirin ve kalp durduğunda kalbi iki dakika daha perfüzyonlayın. Enzim çözeltisini perfuse, sindirim iki dakika sonra rezervuar içine geri enzim çözeltisi sirkülasyon başlar ve sindirim beş dakika sonra dakikada 16 mililitre hızı azaltmak. Doku 40-50 dakika sindirim sonra yumuşak görünür sonra, kanül kapalı kalp kesti ve hemen engelleme çözeltisi kalp yerleştirin.
Doku tamamen kapsana kadar engelleme çözeltisi ekleyin. Sağ ventrikül ve septumu kesin ve sol ventrikülü ayırın. Papiller kasları çıkarın ve hafifçe mekanik ayrışma ile hücreleri serbest bırakmak için doku ayrı çekmek için ince çalgılar ve bir pipet kullanın.
Hücre süspansiyonunu bir milimetre karegözenekli bir kafesten süzün ve hücreleri santrifüj le çökün. Sonra taze bloklama çözeltisi kardiyomiyosit pelet resuspend. Bir yama kıskaç deneyi için, hücre kültüründen hemen önce mililitre başına 100 mikrogram laminin içeren petri kabındaki kaplamaları katlayın.
Karbon fiber deneyi için, 95-5 etanol-to-su çözeltisi poli-HEMA mililitre başına 0,12 gram ile kat Petri yemekleri. Kardiyomiyositleri yeniden suladıktan 10 ila 15 dakika sonra süpernatantı çıkarın ve kültür ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın. Saydıktan sonra, mililitre başına dört hücre ye 1.75 kez 10 hedef yoğunluğunda bir Petri kabında bir coverslip üzerine hücreleri tohum.
Kültürleri 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitte 3-4 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, 75 enfeksiyon çokluğu gtacr1-eGFP için adenovirüs tip beş kodlama içeren taze orta ile coverslip kültürlerden orta değiştirin. Kültürleri 48 saat boyunca kuvöze geri döndürün.
Yama kelepçesi deneyi yapmak için, soda kireç cam kılcal damarlarından 1,7 ila 2,5 megaohm yama pipetleri çekmek ve veri toplama yazılımını çıkarmak için bir mikropipet çekmecesi kullanın. Dış solüsyon içeren ölçüm odasına hücrelerle bir kapak yerleştirin ve eGFP floresansına göre kardiyomiyositi seçin. Daha sonra, bir yama pipetini dahili solüsyonla doldurun ve pipet tutucuya takarak iç çözeltiye gümüş klorür kaplı gümüş kayıt kablosunu yerleştirin.
Membran testini sıfır milivolt taban çizgisiyle 15 milivolt için 10 milivolt darbe uygulayacak şekilde ayarlayın. Hücreye bağlı yapılandırmaya ulaştıktan sonra, veri toplama yazılımında eksi 60 milivolt tutma potansiyeline sahip tüm hücre moduna geçin. Daha sonra membranı yırtarak tüm hücre yapılandırmasına erişmek için hafifçe negatif basınç uygulayın.
Başarılı bir yırtık ölçülen kapasitans ani bir artış ile kanıtlanacaktır. Eksi 74 milivoltışık darbeli voltaj kelepçesi modunda fotoaktivasyon protokollerini 300 milisaniyelik ışık darbeleri veya sıfır pikoampere'de mevcut kelepçe modunda ki eylem potansiyelleri ile kaydedin. Karbon fiberleri üretmek için, önce pipeti çekmecenin pipet tutucularına monte edin.
Toplam konik uzunluğu yaklaşık 11 milimetre ve yaklaşık 30 mikrometre son iç çapı ile iki pipetler içine cam kılcal çekin. Daha sonra, bir kapiller iyönde ki bir kılcal damarı hizalamak için stereo mikroskop kullanın ve bir bükücü ile kılcal damarın ucunu aşağı iterek 45 dereceye kadar bükün. Kılcal damar, bükücü çıkarıldıktan sonra bile 45 derecelik açıyı koruyana kadar filamenti ısıtın.
Kılcal damarı büktükten sonra, yumuşak boru ile donatılmış ince çifekler kullanarak tüpten bir karbon fiber çıkarve kılcal damarın ince ucuna sığdırın. Kılcal damardaki lifleri viraja kadar itin. Karbon fiberleri kesin, böylece kapillerin ucundan iki mililitre yansıtın ve her kapillerin ön kısmına lifleri onarmak için siyanoakrilat tutkal kullanın.
Lifleri kalibre etmek için, bir mikromanipülatör ve piezo motor tarafından kontrol edilen bir tutucuya bir kılcal damar takın. Kılcal damarı sensöre doğru hareket ettirin ve sensöre göre hizalayın. Herhangi bir kuvvet üretmeden güç sensörü ile temas fiber ucu yerleştirin.
Piezo motorun toplam hareketi 60 mikrometredir. Piezo motorunu kuvvet sensörüne doğru 10 mikrometrelik altı adımda hareket ettirin. Sensör volt başına 0.05 milinewton hassasiyete ve sıfır ile 0,5 milinewton arasında bir kuvvet aralığına sahiptir.
Her adım için ölçülen gerilimi okuyun ve sensörden karbon fiberi çıkarın. Kardiyomiyositlerin kasMa kuvvetini kaydetmek için, Poly-HEMA ile bir kapak camının yüzeyini kaplayın ve ölçüm odasına yerleştirin. Odayı dış banyo solüsyonu ile doldurun.
Her iki karbon fiber yüklü kılcal damarı sahne mikromanipülatörüne takın ve karbon fiberlerinin ölçüm odasının yüzeyine yatay alabilmeleri için bir açıyla hizalayın. Liflerin doğru hizalanıp hizalanıp uyumaz olduğunu kontrol etmek için, ölçüm odasının yüzeyine odaklanın, ilk elyafı indirin ve fiberi yatay olarak hareket ettirin. Lifin ucu ölçüm odasının yüzeyinde kayar olmalıdır.
İkinci lif için aynı prosedürü izleyin. Işıklar kapalı, odasına kültürlü hücre süspansiyon birkaç damla ekleyin ve yeşil ışık uyarılma yanıt olarak sözleşme hücreleri seçmek için kısa yeşil ışık darbeleri uygulayın. İlk elyaf eklemek için, yavaşça lif düşürerek hücre sıkıştırın sonra basınç bırakın.
İki lif arasında maksimum sayıda sarcomere satılabilmesi için kardiyomiyositin diğer ucundaki ilk elyafa paralel ikinci lifi takın. Her iki lif de bağlandıktan sonra, lifleri kaldırın, böylece hücre artık oda yüzeyi ile temas halinde değildir. Sarcomeres odak haline getirin, lifler arasında sarcomere uzunluğu izleme penceresi ayarlamak ve fiber bükme izlemek için kenar algılama modülü kullanın.
Algılama alanlarını kırmızı ve yeşil pencerelerle ayarlayın ve ışık yoğunluğu izlemenin ilk türevi olan bir eşik tanımlayın. Sarcomere uzunluğu ve lif bükme izleme sırasında optik hız hücre. Bu durumda, 0.25 hertz tempolu.
En az 15 optik olarak ortaya konan kasılmaları kaydettikten sonra, alan hücreyi elektriksel olarak uyarır. Kasılmaları çıkarmak için eşiği bulun ve elektrik voltajı için eşik geriliminin 1,5 katını uygulayın. Bir inhibisyon protokolü için, kasılmalar ortaya çıkarmak için elektriksel uyaranları uygulayın ve daha sonra çeşitli ışık yoğunluklarında sürekli bir ışık darbesi için hücre maruz.
Işık kaynaklı inhibisyon sonrası en az 15 kasılma kaydedin. GtACR1 kültürlü tavşan kardiyomiyositleri ile ifade edilir. GtACR1 fotoaktivasyonu milimetre başına dört miliwatt'lık bir ışık yoğunluğunda 300 milisaniye boyunca büyük içe dönük akımlar eksi 74 milivolt ve 245 pikoampere ile ölçülü bir pik akımla sonuçlanır.
Bu temsili deneyde, eylem potansiyelleri ya elektriksel olarak akım enjeksiyonları ile tetiklendi 1.5 kez eşik veya optik 10 milisaniyelik ışık darbeleri ile. Optik tempolu kardiyomiyositler daha yavaş bir etki potansiyeli başlangıcı gösterdi. Elektriksel olarak tetiklenen etki potansiyelleri sürekli ışık altında inhibe edildi.
Daha yüksek akım enjeksiyonları ve sürekli ışık uygulaması sırasında eşiğin 1,5 katı eşik de eylem potansiyelleri ortaya çıkarmak değildir. Kardiyomiyosit, optik pacing'i takiben milimetre nin karesi olan 232 mikronewton luk bir daralma kuvveti ve milimetre başına 261 mikronewton üretti. Uzun süreli yeşil ışık darbeleri, tavşan kardiyomiyositlerinden gelen diyastolik kalsiyum kaybına uygun olarak daha düşük kontraktil kuvvet üreten inhibisyon sonrası tekrarlayan kasılmalar ile kasılmaları inhibe etti.
Bir deney yapmadan önce teknikleri uygulamanızı öneririz, özellikle de mikroprobları karanlıkta konumlandırmak zor olabilir. güç üretimini ve gevşemeyi etkileyebileceğinden kardiyomiyosit kontraktür analizi yapılırken çok önemlidir. İzotonik ve yardımcı kontraksiyon analizi için çeşitli afterloads da uygulanabilir.
Bu teknikler, her deney için en uygun optogenetik aracın seçilmesi için çok önemli olan kardiyomiyositlerde yeni geliştirilen optogenetik aktüatörlerin aktive edilmesinin biyofiziksel etkilerinin karakterizasyonuna olanak sağlar. Adenovirüs transdüksiyonu ve transdüksiyonu takip eden tüm adımların biyogüvenlik seviyesi II koşullarında yapılması gerektiğini lütfen unutmayın.
