فشل القلب هو السبب الرئيسي للوفاة لكل من الرجال والنساء في العالم. تشير الأدلة الجديدة إلى أن التغيير في التمثيل الغذائي القلبي والنظامي يساهم في أمراض قصور القلب. تحديد بسرعة التي الأيض تؤثر على الإثارة انكماش اقتران لا يزال تحديا.
النهج التقليدي لعزل myocyte القلب من الماوس الكبار هو عملية تستغرق وقتا طويلا وصعبة. يجعل الأسلوب المبتكر في هذه المقالة عملية صارمة أكثر كفاءة وأسهل لتنفيذ. وعلاوة على ذلك، باستخدام مسبار الفلورسنت، يمكننا إجراء العديد من التقييمات الظاهرية لكيفية المواد الكيميائية يمكن أن تحفز سمية القلب أو الخلل الوظيفي على المستوى الخلوي.
من خلال تحديد الجزيئات التي تغير وظيفة myocyte ، يمكن تحديد علاجات جديدة لعلاج قصور القلب. باستخدام الفئران المعدلة وراثيا، يمكننا التحقيق الجينات المختلفة لتحديد أي يمكن أن تمنع والمساهمة في فشل القلب. هذه المعلومات ستكون ضرورية في المستقبل علاج قصور القلب.
سيكون إثبات الإجراء هو ماثيو كلوس والطالب شرياس سوريش. للبدء، ذوبان محلول العمل في اللامينين على الجليد. باستخدام ماصة P1000، pirate 200 ميكرولترات من اللامينين واسحب بلطف تلميح ماصة على طول حافة واحدة من غطاء معقمة للسماح للعمل الشعري لسحب كمية ضئيلة من اللامينيين لتسهيل ملحق أغطية إلى لوحة ستة جيدا.
ثم طرد اللامينين المتبقي في وسط الغطاء في حركة دائرية. نشر قطرات اللامينين عبر الغطاء. ضع الغطاء في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل وحتى 24 ساعة قبل العزل.
لعزل الخلايا الميوسية من القلب المعد في KHB-HB الباردة، ضع العينة تحت مجهر ستيريو. لمنع emboli، رئيس كانية الأبهري عن طريق غمره في حل KHB-HB واستخدام حقنة 20 ملليلتر لفرض الحل من خلال. تأكد من أن القلب مغمور وأن القنية مهيأة قبل ختان القلب.
مع 5 ملقط، cannulate القلب. تأكيد الموضع السليم للقنية عن طريق تصور طرف القنية ما يقرب من ملليمتر واحد فوق الإدراج الأبهري في البطين. ثم بدء تدفق KHB-HB عن طريق تدوير الـ stopcock على Langendorf.
ربط القنية إلى Langendorf لثقب القلب لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، قم بتدوير الـ stopcock للتبديل إلى الضخ من خزان KHB-HB إلى خزان العازلة للهضم. بمجرد أن يصل المخزن المؤقت للهضم إلى القلب ، قم بتعيين جهاز توقيت.
جمع perfusate في منقار 100 ملليلتر العقيمة. إعادة ملء خزان عازلة الهضم حسب الحاجة مع perfusate حتى وقت الهضم قد انتهت. بعد الهضم ، في منقار معقمة 100 ملليلتر ، افصل غرف القلب مع ملقط ومقص إيريس.
ضع كل غرفة في بئر منفصل من لوحة ستة بئر. صب خمسة ملليلتر من محلول الكولاجيناز في كل بئر. على الفور استخدام مقص ل mince أنسجة القلب إلى قطع من ما يقرب من متر مكعب واحد.
باستخدام ماصة نقل معقمة، triturate بلطف أنسجة القلب المفروم مع العازلة الهضم. بمجرد أن تصبح قطع الأنسجة بيضاء وريشية ، ضع اللوحة تحت مجهر مقلوب لفحص الخلايا. إذا كان عدد الخلايا القابلة للحياة أكبر من 80٪ المضي قدما في الضغط على الخلايا في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر باستخدام مصفاة خلية 100 ميكرون.
إذا كان عدد الخلايا القابلة للحياة أقل من 80٪ تحقق من الوقت الذي استغرقه لقنينة. إذا كان وقت التكبيب أكثر من خمس دقائق، حاول قلب آخر. إذا لم يكن كذلك، فحص فتحات الكولاجين الجديدة من خلال برنامج أخذ العينات collagenase.
بعد ذلك، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 215 مرات ز لمدة دقيقتين. يجب أن تكون بيليه مدمجة وليس فضفاضة. إذا كان بيليه فضفاضة، وإعداد يحتوي على العديد من الخلايا الميتة.
في غطاء لثقافة الأنسجة، resuspend بيليه المدمجة في 10 ملليلتر من وقف العازلة. بيليه الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي في 215 مرات ز لمدة دقيقتين. إعادة تعليق الخلايا في خمسة ملليلترات من العازلة الطلاء.
قم بإجراء عدد الخلايا على عداد cyto وضبط حجم المخزن المؤقت للطلاء للوصول إلى تركيز myocyte نهائي من مرتين 10 إلى الخلايا الأربع لكل ملليلتر. الآن إزالة الغطاء المغلفة باللامينين من الحاضنة. التعرق قطرات اللامينين إذا كان حاضرا.
لوحة 200 ميكرولترات من تعليق myocyte على كل غطاء. ضع الغطاء في حاضنة 37 درجة مئوية مع 21٪ من الأكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين للسماح بالتعلق. بعد ساعتين، أخرج الأغطية وترشّح الخلايا غير المُرَزَة.
إضافة ملليلترين من الثقافة والإعلام والثقافة في الحاضنة في 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى أربعة أيام. أولا، إزالة المكون A والمكون B من مجموعة الغشاء المحتملة. في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر، والجمع بين 50 ميكرولترات من المكون B وخمسة ميكرولترات من المكون ألف لتشكيل خليط صبغ الجهد.
دوامة لخلط. إضافة 10 ملليلتر من وسائل الاعلام الطلاء إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر تحتوي على خليط صبغ الجهد لتشكيل خليط صبغة الغشاء المحتملة. مرة أخرى، دوامة لخلط.
ثم إزالة واحدة من لوحة ستة جيدا من myocytes من الحاضنة. استلهم وسائل الإعلام. إضافة 800 ميكرولترات من خليط صبغة الغشاء المحتملة لكل بئر.
غطي الطبق بالرقائق واتركيه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، التعرق الخليط وسائل الإعلام صبغ من كل بئر وإضافة ملليلتر واحد من حل Tyrode تعديل لكل بئر. تغطية مع احباط.
بدوره على المعدات في ترتيب المجهر، مصباح القوس، HyperSwitch، نظام واجهة الفلوريسين، إمدادات الطاقة MyoCam، محفز الميدان، والكمبيوتر. تأكد من أن مجموعات مرشح الانبعاثات الإثارة مناسبة لصبغة التصوير. على سبيل المثال، تشعر فورا-2 بالحماسة عند 340 نانومتر و380 نانومتر من الضوء.
تنبعث منه في 510 نانومتر من الضوء. Fluo-4 وصبغة غشاء الجهد متحمسون في 485 نانومتر من الضوء وتنبعث في 520 نانومتر من الضوء. رئيس نظام التسجيل عن طريق تشغيل الفراغ، وفتح تماما المشبك خرطوم، وتغرق بلطف كل حقنة 60 ملليلتر مع حل تيرود في متعددة.
لتسجيلات الكالسيوم، استخدم حل Tyrode القياسي. لتسجيلات الجهد، استخدم حل Tyrode المعدل. بدوره على سخان في خط.
الحفاظ على درجة الحرارة حتى perfusate في الغرفة هو في 36 زائد أو ناقص درجة مئوية واحدة لمدة 15 دقيقة على الأقل. بعد ذلك، افتح برنامج الاستحواذ. تأكد من تعيين المعلمات لصبغة التصوير الصحيحة.
إيقاف تشغيل محفز. في الظلام، وإزالة احباط من لوحة ستة جيدا ووضع غطاء في غرفة سرعة. ضع اللوحة تحت المجهر وركز على الخلايا الميوسية باستخدام هدف 10X.
مرة واحدة في التركيز، بدء سرعة عن طريق تحفيز الميدان في هرتز واحد و 0.2 فولت. زيادة تدريجيا الجهد حتى يتم الحصول على سرعة واحد إلى واحد. ثم زيادة الجهد حتى 1.5 مرات يتم الوصول إلى عتبة.
التحول من الهدف 10X إلى الهدف 40X. التركيز على الخلية التي تتبع سرعة واحد إلى واحد. ضبط ظلال البلاستيك حتى خلية واحدة فقط في مجال الرؤية.
باستخدام البرنامج، ضع منطقة مربع الاهتمام على ساركوميريات محددة جيدا. بدء برنامج اقتناء لبدء ضوء الإثارة. باستخدام مرشحات الكثافة المحايدة، قم بضبط إعداد الكثافة وفقًا لذلك للحصول على نسبة إشارة إلى ضوضاء كافية.
هنا، يتم عرض الكالسيوم ممثل وsarcomere تقصير آثار المسجلة من myocytes الماوس C57BL/6 باستخدام الفورا-2. ولا يظهر القياس الكمي للبيانات متوسطة المجموعة التي تم الحصول عليها من فئران C57BL/6 وزملائهم في القمامة المعدلة وراثيا أي فرق بين المجموعات باستثناء وقت الاسترخاء في سرعة 10 هيرتز. تم معالجة تتبع الجهد المسجلة من myocyte الماوس C57BL/6 يسير بخطى في 10 هيرتز للحصول على إشارة قابلة للاستخدام.
متوسط إمكانات العمل الفرقة بعد تمريرة منخفضة بتروورث أو مرشح الرقمية سافيتزكي-Golay تم تطبيقها تظهر اختلافات خفية في شكل إمكانات العمل. الآثار المسجلة من myocytes الفئران يسير بخطى في واحد يظهر هيرتز بالإضافة إلى إشارة الجهد يجري أقل من إشارة الكالسيوم، وانكماش الحركية مختلفة كذلك. وذلك لأن الكالسيوم الأصباغ العازلة الكالسيوم في حين أن الأصباغ الجهد لا.
كما هو الحال مع عابر الكالسيوم، أظهرت myocytes سرعة تعتمد التغييرات في المدة المحتملة العمل البصري. كما ثبت أن إطالة أمد العمل المحتمل الناجم عن المخدرات قد تم أيضا. أشارت الثواني الـ 11 الأخيرة من تسجيل مدته 20 ثانية إلى أن التعرض المطول للضوءات الزُرقية يؤدي إلى النشاط المُثار.
عند محاولة هذا الإجراء، فإن أهم شيء يجب تذكره هو استخدام أدنى ضوء كثافة ممكن حتى لا تلحق الضرر بالوسيعات. Myocyte معزولة باستخدام نهجنا يمكن أيضا أن تستخدم للكيمياء المناعية أو أجريت لتحليل البقعة الغربية. جمال هذه التقنية، فإنه يسمح للباحثين لتقييم سريع كيف تنوع الجزيئات والجينات تساعد على اقتران الإثارة الانكماش باستخدام نظام واحد.
