O uso do protocolo como efeito biofísico de diferentes atuadores optogenéticos na atividade cardiomiócito pode ser testado para auxiliar no desenvolvimento de experimentos optogenéticos em tecido cardíaco e corações inteiros. Combinando a técnica de remendo com o rastreamento de sarcomere e as medidas de força assistida por fibra de carbono, podemos estudar os efeitos da fotoativação gtACR1 nos elétricos e mecânicas dos cardiomiócitos ventriculares. A inibição optogenética pode potencialmente ser usada para desfibrilação óptica.
GtACR1 é uma ferramenta optogenética que permite o silenciamento da atividade cardíaca. Esta técnica é totalmente aplicável a outros campos de pesquisa, como estudos de células musculares lisas e unicelulares. Embora este protocolo não possa ser usado para triagem de alto rendimento, ele fornece um meio para a análise abrangente da função elétrica e mecânica cardiomiócito.
Então, como diz o ditado, uma imagem diz mais de mil palavras. Quanta informação mais podemos obter em vídeo? Algumas de nossas ferramentas e técnicas envolvidas no alongamento de miócito único e na preparação da sonda são altamente complexas e é muito mais fácil transmiti-las em um vídeo em comparação com uma descrição.
Depois que o sangue foi retirado do coração salino perfusado de um coelho branco neozelandês de nove a 10 semanas, mude o perfusado para uma solução de baixo cálcio, alta potássio e perfumar o coração por mais dois minutos depois que o coração parar de bater. Perfunda a solução enzimácula, comece a recircular a solução enzimátil de volta ao reservatório após dois minutos de digestão, e diminua a velocidade para 16 mililitros por minuto após cinco minutos de digestão. Uma vez que o tecido pareça macio após 40-50 minutos de digestão, corte o coração da cânula e coloque imediatamente o coração na solução de bloqueio.
Adicione a solução de bloqueio até que o tecido esteja totalmente coberto. Corte o ventrículo direito e o septo e separe o ventrículo esquerdo. Remova os músculos papilares e use fórceps finos e uma pipeta para retirar suavemente o tecido para liberar as células por dissociação mecânica.
Filtre a suspensão celular através de uma malha com um milímetro de poros quadrados e sedimente as células por centrifugação. Em seguida, resuspense a pelota de cardiomioce em solução de bloqueio fresco. Para um experimento de grampo de remendo, cubra as tampas autoclavadas em uma placa de Petri com 100 microgramas por mililitro de laminina imediatamente antes da cultura celular.
Para o experimento da fibra de carbono, cubra as placas de Petri com 0,12 gramas por mililitro de Poly-HEMA em uma solução de 95 a 5 etanol-água. Dez a 15 minutos depois de reutilizar os cardiomiócitos, remova o sobrenatante e resuspense as células em meio de cultura. Após a contagem, semeou as células em um deslizamento em uma placa de Petri a uma densidade alvo de 1,75 vezes 10 para as quatro células por mililitro.
Incubar as culturas por três a quatro horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Ao final da incubação, substitua o meio das culturas de deslizamento de cobertura por meio fresco contendo codificação tipo 5 de adenovírus para GtACR1-eGFP em uma multiplicidade de infecção de 75. Devolva as culturas à incubadora por 48 horas.
Para realizar um experimento de grampo de remendo, use um puxador de micropipette para puxar pipetas de remendo de 1,7 a 2,5 megaohm de capilares de vidro de limão refrigerante e inicializar o software de aquisição de dados. Coloque uma mancha de cobertura com células na câmara de medição contendo solução externa e selecione o cardiomiócito com base em sua fluorescência eGFP. Em seguida, encha uma pipeta de remendo com solução interna e conecte a pipeta ao suporte da pipeta inserindo o fio de gravação de prata revestido de cloreto de prata na solução interna.
Defina o teste de membrana para aplicar pulsos de 10 milivoltes por 15 milissegundos com uma linha de base de zero milvolts. Depois de atingir a configuração conectada por células, mude para o modo celular inteiro com um potencial de retenção de menos 60 milvolts no software de aquisição de dados. Em seguida, aplique suavemente pressão negativa para acessar toda a configuração celular rompendo a membrana.
Uma ruptura bem sucedida será evidenciada por um aumento imediato da capacitância medida. Registos de fotoativação no modo de fixação de tensão a menos 74 milivolts com pulsos de luz de 300 milissegundos ou potenciais de ação no modo de fixação atual a zero picoampere. Para produzir as fibras de carbono, primeiro monte a pipeta sobre os suportes de pipeta do puxador.
Puxe os capilares de vidro em duas pipetas com um comprimento total afilado de aproximadamente 11 milímetros e um diâmetro interno final de cerca de 30 micrômetros. Em seguida, use um microscópio estéreo para alinhar um capilar no círculo de orientação e dobre-o em até 45 graus empurrando para baixo na ponta do capilar com um dobrador. Aqueça o filamento até que o capilar mantenha o ângulo de 45 graus mesmo depois que o dobrador for removido.
Depois de dobrar o capilar, use fórceps finos equipados com tubos macios para tirar uma fibra de carbono do tubo e encaixá-la na ponta fina do capilar. Empurre a fibra no capilar até a curva. Corte as fibras de carbono para que elas projetem dois mililitros da ponta do capilar e usem cola cianoacrilato para fixar as fibras na parte frontal de cada capilar.
Para calibrar as fibras, conecte um capilar a um suporte controlado por um micromanipulador e um motor piezo. Mova o capilar em direção ao sensor e alinhe-o em relação ao sensor. Coloque a ponta da fibra em contato com o sensor de força sem produzir nenhuma força.
O movimento total do motor piezo é de 60 micrômetros. Mova o motor piezo em seis passos de 10 micrômetros em direção ao sensor de força. O sensor tem uma sensibilidade de 0,05 mililitros por volt e uma faixa de força de zero a 0,5 mililitros.
Leia a tensão medida para cada etapa e remova a fibra de carbono do sensor. Para registrar a força da contração de cardiomiócitos, cubra a superfície de uma viheta com Poly-HEMA e coloque-a na câmara de medição. Encha a câmara com solução externa de banho.
Conecte ambos os capilares carregados de fibra de carbono ao micromanipulador de estágio e alinhe-os em um ângulo para que as fibras de carbono estejam próximas da horizontal à superfície da câmara de medição. Para verificar se as fibras estão corretamente alinhadas, concentre-se na superfície da câmara de medição, baixe a primeira fibra e mova a fibra horizontalmente. A ponta da fibra deve estar deslizando na superfície da câmara de medição.
Siga o mesmo procedimento para a segunda fibra. Com as luzes apagadas, adicione algumas gotas de suspensão de células cultivadas à câmara e aplique pulsos curtos de luz verde para selecionar células que se contraem em resposta à estimulação da luz verde. Para fixar a primeira fibra, comprimprete suavemente a célula baixando a fibra e solte a pressão.
Conecte a segunda fibra paralela à primeira na outra extremidade do cardiomiócito, a fim de ter um número máximo de sarcomeres entre as duas fibras. Depois que ambas as fibras estiverem presas, levante as fibras para que a célula não esteja mais em contato com a superfície da câmara. Coloque os sarcomeres em foco, coloque a janela de rastreamento de comprimento sarcomere entre as fibras e use o módulo de detecção de borda para rastrear a dobra de fibra.
Defina as áreas de detecção com as janelas vermelhas e verdes e defina um limiar na primeira derivada do traço de intensidade da luz. Acelere o ritmo óptico da célula enquanto rastreia o comprimento do sarcomere e a dobra de fibras. Neste caso, nós caminhamos a 0,25 hertz.
Após gravar pelo menos 15 contrações opticamente provocadas, o campo estimula a célula eletricamente. Encontre o limiar para provocar as contrações e aplique 1,5 vezes a tensão limiar para o ritmo elétrico. Para um protocolo de inibição, aplique estímulos elétricos para provocar contrações e, em seguida, exponha a célula a um pulso de luz sustentado em várias intensidades de luz.
Registe pelo menos 15 contrações após inibição induzida pela luz. GtACR1 é expresso em cardiomiócitos de coelho cultivados. A fotoativação gtACR1 a uma intensidade leve de quatro miliwatts por milímetro ao quadrado por 300 milissegundos resulta em grandes correntes direcionadas para dentro a menos 74 milvolts com uma corrente de pico medida de 245 picoampere.
Neste experimento representativo, potenciais de ação foram acionados eletricamente com injeções atuais 1,5 vezes o limiar ou opticamente com pulsos de luz de 10 milissegundos. Cardiomiócitos ópticos em ritmo óptico demonstraram um início potencial de ação mais lento. Potenciais de ação acionados eletricamente foram inibidos sob luz sustentada.
Injeções correntes mais altas e 1,5 vezes o limiar durante a aplicação de luz sustentada também não provocam potenciais de ação. O cardiomiócito gerou uma força de contração de 232 micronovtons por milímetro quadrado sobre o ritmo elétrico e 261 micronovtons por milímetro quadrado após o ritmo óptico. Pulsos de luz verde prolongados inibiram as contrações com as contrações recorrentes pós-inibição gerando uma menor força contratil de acordo com a perda diastólica de cálcio dos cardiomiócitos do coelho.
Recomendamos praticar as técnicas antes de realizar um experimento, particularmente porque o posicionamento das microprobes no escuro pode ser desafiador. é muito importante ao analisar a contratude do cardiomiócito, pois pode afetar a produção e o relaxamento da força. Várias cargas posteriores também podem ser aplicadas para análise de contração isotônica e auxotônica.
Essas técnicas permitem a caracterização dos efeitos biofísicos da ativação de atuadores optogenéticos recém-desenvolvidos em cardiomiócitos, o que é crucial para a seleção da ferramenta optogenética mais adequada para cada experimento. Esteja ciente de que a transdução do adenovírus e todas as etapas após a transdução devem ser realizadas sob condições de biossegurança nível II.
