Этот протокол облегчает изоляцию и воспроизводимую долгосрочную культуру гепатоцитов мыши в среде сэндвича 3D коллагена для изучения формирования канонической структуры и ее реакции на лечение в пробирке. После того, как метод был освоен, это быстрый метод для получения больших объемов высокой жизнеспособности и чистой популяции гепатоцитов мыши для исследований in vitro. Демонстрацией процедуры будет Ленка Сарнова, техник из нашей лаборатории.
За день до первичной изоляции гепатоцитов добавьте 100 микролитров 10X DMEM, 485 микролитров дистиллированной воды и 15 микролитров одного гидроксида молярного натрия в 500 микролитров в крысиный хвост коллагена. Проверьте рН нейтрализованного коллагена. Она должна быть около 7,5.
Используя предварительно охлажденный 200 микролитровых пипеток наконечник, распространение 100 микролитров нейтрализованного раствора коллагена над каждым из пластиковых 3,5 сантиметра диаметром культуры блюда на льду и место блюда в стандартных условиях культуры на ночь. На следующее утро, регидратировать коллагена слоев с одним миллилитр 37 градусов по Цельсию PBS на блюдо, по крайней мере три часа при 37 градусов по Цельсию. Чтобы изолировать печень, подтвердив отсутствие реакции на щепотку ноша, поместите анестезированные мыши на коврик для вскрытия в положении на спине и ленты нижних и верхних конечностей к коврику.
Шваб брюшной полости с 70%этанола и сделать V-образный разрез из лобковой области для каждого forelimb. Сложите кожу над грудью, чтобы раскрыть брюшную полость и поместите коврик под рассекающий микроскоп. Перемещение тонкой кишки и толстой кишки в хвостовом направлении подвергать IVC и загрузить два миллилитров шприца с 2,5 миллилитров 37 градусов по Цельсию решение C.Connect шприц к канюле и использовать PBS пропитанной ватным тампоном, чтобы нажать печень до диафрагмы.
Поместите пропитанный шов вокруг IVC чуть ниже печени. Затем с помощью инсулинового шприца, оснащенного 30-дюймовой иглой, согнутой под углом 45 градусов, ввилите в портал 10 микролитров по 5 000 единиц на миллилитр гепарина. Чтобы канюлировать печень, используйте микрохирургические ножницы, чтобы сделать небольшой разрез в IVC непосредственно рядом с печенью и вставить канюлю в разрез.
Безопасные канюли на месте с швами и два хирургических узлов и сократить портал вены, чтобы перфузии буферов вытекать из печени. Затем медленно угнетают поршень шприца, чтобы пронизать печень двумя миллилитров раствора в течение примерно 15 секунд. Когда все решение было доставлено, предварительно заполнить перистальтический насос со свежим 37 градусов по Цельсию раствор C и проверить перфузионный аппарат, чтобы убедиться, что Есть нет пузырьков воздуха в системе.
Аккуратно отсоедините канюлю от шприца и быстро, но осторожно соедините трубы бегущего перистального насоса с канюлей. Немедленно начните перфузию со скоростью потока 2,5 миллилитров в минуту. Через две минуты переключитесь на раствор D и продолжайте перфузию еще на 10 минут.
В конце перфузии, тщательно собрать печень в 50 миллилитров конической трубки, содержащей 20 миллилитров 37 градусов по Цельсию решение E.To изолировать первичные гепатоциты, держа печень канюли, руб ткани вокруг стенки трубки, чтобы постучать гепатоцитов в буфер. Когда все ткани были пюре, передать ткани суспензии в 70 микрометровый поры нейлоновый ситечко для фильтрации изолированных клеток в новую 50 миллилитровую трубку. Осадок клеток печени центрифугации и повторно гранулы в 20 миллилитров 40%Percoll в DMEM.
Отделить живые и мертвые клетки центрифугации и повторно гранулы в 20 миллилитров раствора E.After центрифугирования клеток снова, повторно гранулы в 10 миллилитров свежего раствора E для подсчета. После подсчета, настроить первичный гепатоцитов рассчитывать до 3,75 раз 10 до пяти жизнеспособных клеток на миллилитр гепатоцитов культуры среды. Для культуры изолированных первичных гепатоцитов в 3D коллаген бутерброды, использовать один миллилитр пипетки равномерно распределить два миллилитров клеток на каждый коллаген покрытием 3,5 сантиметра диаметром блюдо.
Поместите клетки в инкубатор клеточной культуры на три часа. Во время инкубации приготовьте 100 микролитров нейтрализованного крысиного хвоста коллагена по одному раствору на тарелку, как это было продемонстрировано. В конце инкубации тщательно замените средние и незакрепленные клетки 100 микролитров нейтрализованного коллагена на тарелку и верните пластины в инкубатор клеточной культуры на час.
Когда коллаген затвердел, осторожно добавьте два миллилитров свежей среды культуры гепатоцитов к каждому блюду и верните культуры в инкубатор в течение трех-восьми дней, ежедневно проверяя культуры под микроскопом. Для иммунолабеля первичных гепатоцитов в 3D коллаген бутерброды, мыть каждый бутерброд тщательно с 37 градусов по Цельсию PBS и исправить культур с одним миллилитр 4%paraformaldehyde в PBS на блюдо в течение 30 минут при комнатной температуре. В конце фиксации, мыть посуду три раза в течение 10 минут в двух миллилитров PBS дополняется 0,1%Tween 20 за стирку.
После последней стирки, permeabilize клетки с одним миллилитр 0,1 молярного глицина и 0,2%Triton X-100 в PBS в течение одного часа при комнатной температуре, а затем три моет в PBS плюс Tween 20, как только что продемонстрировали. Затем используйте наконечник нагрузки на 10 микролитров, подключенный к вакууму, чтобы мягко нарушить верхний слой коллагена и блокировать любые неспецифические связывания с одним миллилитром 5%бычьего альбумин сыворотки в PBS Tween в течение двух часов. В конце инкубации добавьте первичные антитела интереса, разбавленные блокирующим раствором, к каждому блюду и инкубировать на ночь при 37 градусах по Цельсию.
На следующее утро, мыть посуду с тремя 15-минутные моет в PBS Tween следуют маркировки с соответствующими вторичными антителами при 37 градусов по Цельсию в течение пяти часов. В конце инкубации, мыть культур два раза с PBS Tween и один раз с дистиллированной водой, как попродемонстрировано перед монтажом блюдо с анти-увядание монтажа среды для микроскопии. В течение одного дня посева в 3D-сэндвичах с коллагеном первичные гепатоциты мыши образуют кластеры и самоорганикуются в примерно обычной сети желчных каналикули.
В течение трех-шести дней, кластеры от пяти до 10 клеток, как правило, наблюдается с полностью поляризованных гепатоцитов формирования каналикулярной сети. Лечение либо токсином, либо цитоскелетными препаратами приводит к изменениям в цитоскелете гепатоцитов и ширине, форме и количестве желчных каналикули. Хотя обработка этанолом проявляет лишь мягкое влияние на организацию кератина 8, она увеличивает тортуозность и распределение ширины желчных каналов.
Интенсивность сигнала окрашивания ЗО-1 снижается в обработанных этанолом желчных каналикулах по сравнению с необработанными контролями, что свидетельствует о потере типовых соединений после обработки этанолом. Ингибирование актомиозина контрактность с Blebbistatin вызывает образование беспорядочной формы, толстые, округлые желчи canaliculi. Кроме того, лечение окадаевой кислотой подавляет фосфаты, сильно влияющие на физические свойства кератинов и приводящие к желчи canaliculi, которые значительно сужены по сравнению с необработанных контроля.
Кроме того, лечение этанолом значительно повышает уровень как аланина, так и аспартата аминотранспортазы предлагая тяжелые гепатоцеллюлярные травмы в то время как Blebbistatin лечение не приводит к каким-либо изменениям рассмотрения в уровнях трансаминазы и окадайской кислоты лечение вызывает мягкие биохимические изменения в аланина аминотрансферазы, но никаких изменений в аспарат аминотрансферазы выражения. Важно продолжать работать относительно быстро во время канкуляции и в начале перфузии и избегать пузырьков, походящих в систему перфузии. Клеточные лисаты могут быть собраны в дублирующие скважины для белков, представляющих интерес, чтобы определить, происходят ли изменения в экспрессии белка и/или стадиях активации во время лечения.
