Este protocolo facilita el aislamiento y el cultivo reproducible a largo plazo de los hepatocitos de ratón en un entorno sándwich de colágeno 3D para estudiar la formación de la estructura canónica y su respuesta al tratamiento in vitro. Una vez dominada la técnica, es un método rápido para obtener grandes volúmenes de población de hepatocitos de ratón altamente viables y puros para estudios in vitro. Demostrando el procedimiento estará Lenka Sarnova, una técnico de nuestro laboratorio.
El día antes del aislamiento primario de hepatocitos, añadir 100 microlitros de 10X DMEM, 485 microlitros de agua destilada y 15 microlitros de un hidróxido de sodio molar en 500 microlitros a colágeno de cola de rata uno. Compruebe el pH del colágeno neutralizado. Debería ser alrededor de 7.5.
Usando una punta de pipeta pre-enfriada de 200 microlitros, esparza 100 microlitros de la solución de colágeno neutralizado sobre cada una de las placas de cultivo de plástico de 3,5 centímetros de diámetro sobre hielo y coloca los platos en condiciones de cultivo estándar durante la noche. A la mañana siguiente, rehidrata las capas de colágeno con un mililitro de 37 grados Celsius PBS por plato durante al menos tres horas a 37 grados centígrados. Para aislar el hígado, después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del otro, coloque el ratón anestesiado en una estera de disección en la posición supina y pegue las extremidades inferior y superior a la estera.
Swab el abdomen con 70%etanol y hacer una incisión en forma de V desde el área púbica a cada extremidad delantera. Dobla la piel sobre el pecho para descubrir la cavidad abdominal y coloca la estera debajo de un microscopio diseccionado. Mueva el intestino delgado y el colon en la dirección caudal para exponer el CIV y cargue una jeringa de dos mililitros con 2,5 mililitros de solución celsius de 37 grados C.Conecte la jeringa a la cánula y utilice un hisopo de algodón empapado de PBS para presionar el hígado hasta el diafragma.
Coloque una sutura empapada alrededor de la CIV justo debajo del hígado. A continuación, utilizando una jeringa de insulina equipada con una aguja de calibre 30 doblada a un ángulo de 45 grados, inyecte 10 microlitros de 5.000 unidades por mililitro de heparina en la vena porta. Para cannular el hígado, utilice tijeras microquirúrgicas para hacer una pequeña incisión en el CIV directamente al lado del hígado e inserte la cánula en la incisión.
Asegure la cánula en su lugar con suturas y dos nudos quirúrgicos y corte la vena porta para permitir que los tampones de perfusión fluyan desde el hígado. A continuación, presione lentamente el émbolo de la jeringa para perfundir el hígado con dos mililitros de la solución durante un período de unos 15 segundos. Cuando se haya entregado toda la solución, rellene previamente una bomba peristáltica con solución C de 37 grados Celsius fresca y compruebe el aparato de perfusión para asegurarse de que no hay burbujas de aire en el sistema.
Desconecte cuidadosamente la cánula de la jeringa y conecte rápidamente pero cuidadosamente el tubo de la bomba peristáltica en funcionamiento a la cánula. Inicie inmediatamente la perfusión a un caudal de 2,5 mililitros por minuto. Después de dos minutos, cambie a la solución D y continúe la perfusión durante 10 minutos adicionales.
Al final de la perfusión, cosecha cuidadosamente el hígado en un tubo cónico de 50 mililitros que contiene 20 mililitros de solución de 37 grados Celsius E.To aislar los hepatocitos primarios, sosteniendo el hígado por la cánula, frotar el tejido alrededor de la pared del tubo para golpear a los hepatocitos en el tampón. Cuando todo el tejido haya sido machacado, transfiera la lodo tisular a un colador de nylon de poro de 70 micrómetros para filtrar las células aisladas en un nuevo tubo de 50 mililitros. Sedimentar las células hepáticas por centrifugación y resuspend el pellet en 20 mililitros de 40%Percoll en DMEM.
Separar las células vivas y muertas por centrifugación y resuspender el pellet en 20 mililitros de solución E.Después de centrifugar las células de nuevo, resuspend el pellet en 10 mililitros de solución fresca E para el recuento. Después del conteo, ajuste el recuento de hepatocitos primarios a 3,75 veces 10 a las cinco células viables por mililitro del medio de cultivo de hepatocitos. Para cultivar los hepatocitos primarios aislados en sándwiches de colágeno 3D, utilice una pipeta de un mililitro para distribuir uniformemente dos mililitros de células en cada plato recubierto de colágeno de 3,5 centímetros de diámetro.
Coloque las células en la incubadora de cultivo celular durante tres horas. Durante la incubación, preparar 100 microlitros de colágeno neutralizado de cola de rata una solución por plato como se ha demostrado. Al final de la incubación, reemplace cuidadosamente las células medianas y no asociadas con 100 microlitros de colágeno neutralizado por plato y devuelva las placas a la incubadora de cultivo celular durante una hora.
Cuando el colágeno se haya solidificado, añadir cuidadosamente dos mililitros de medio de cultivo de hepatocitos frescos a cada plato y devolver los cultivos a la incubadora durante tres a ocho días comprobando los cultivos diariamente bajo el microscopio. Para el inmunoetiquetado de los hepatocitos primarios dentro de los sándwiches de colágeno 3D, lave cada sándwich cuidadosamente con PBS de 37 grados Celsius y fije los cultivos con un mililitro de 4%paraformaldehído en PBS por plato durante 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la fijación, lave los platos tres veces durante 10 minutos en dos mililitros de PBS complementados con 0,1%Tween 20 por lavado.
Después del último lavado, permeabilizar las células con un mililitro de 0.1 molar glicina y 0.2%Triton X-100 en PBS durante una hora a temperatura ambiente seguido de tres lavados en PBS más Tween 20 como acaba de demostrar. A continuación, utilice una punta de carga de 10 microlitros conectada a un vacío para perturbar suavemente la capa superior de colágeno y bloquear cualquier unión no específica con un mililitro de albúmina sérica bovina al 5% en Tween PBS durante dos horas. Al final de la incubación, añadir los anticuerpos primarios de interés diluidos en solución de bloqueo a cada plato e incubar durante la noche a 37 grados centígrados.
A la mañana siguiente, lave los platos con tres lavados de 15 minutos en PBS Tween seguidos de etiquetado con los anticuerpos secundarios apropiados a 37 grados centígrados durante cinco horas. Al final de la incubación, lave los cultivos dos veces con PBS Tween y una vez con agua destilada como se demostró antes de montar el plato con medio de montaje anti-fade para microscopía. Dentro de un día de siembra en sándwiches de colágeno 3D, los hepatocitos primarios de ratón formaron racimos y se organizaron automáticamente en una red aproximadamente regular de canaleliuli biliar.
En un plazo de tres a seis días, se observan grupos de cinco a 10 células con hepatocitos completamente polarizados que forman una red canalicular. El tratamiento con drogas que alteran la toxina o el citoesqueleto da lugar a cambios en el citoesqueleto del hepatocito y el ancho, la forma y el número de canaliculi biliar. Aunque el tratamiento con etanol sólo presenta un efecto leve en la organización de la queratina 8, aumenta la tortuosidad y distribución de las anchuras canaliculares biliares.
La intensidad de la señal de la tinción DE ZO-1 disminuye en canaluli biliar tratado con etanol en comparación con los controles no tratados que sugieren una pérdida de unión de tipo después del tratamiento con etanol. La inhibición de la contractilidad de la actomiosina con Blebbistatin induce la formación de canaliculi biliar redondeado, grueso y con forma desordenada. Además, el tratamiento con ácido okadaico inhibe las fosfatasas afectando fuertemente las propiedades físicas de las queratinas y resultando en canalículo biliar que se estrechan significativamente en comparación con los controles no tratados.
Además, el tratamiento con etanol eleva significativamente los niveles de alanina y amino transferases de aspartato que sugieren lesión hepatocelular grave, mientras que el tratamiento con Blebbistatina no conduce a ningún cambio en los niveles de transaminasa y el tratamiento con ácido okadaico desencadena cambios bioquímicos leves en la alanina aminotransferasa pero ningún cambio en la expresión de aspartato aminotransferasa. Es importante seguir trabajando con relativa rapidez durante la cánula y al principio de la perfusión y evitar que las burbujas entren en el sistema de perfusión. Los lysates celulares se pueden recolectar en pozos duplicados para proteínas de interés para determinar si se producen cambios en la expresión de proteínas y/o en las etapas de activación durante el tratamiento.
