المؤلفون ممتنون لعلم الأمراض الجزيئية والتصوير الأساسية لمركز جامعة بنسلفانيا NIDDK للدراسات الجزيئية في أمراض الجهاز الهضمي والكبد (P30 DK50306) للحصول على المساعدة مع التصوير. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (R01 DK-092111) ومن Biesecker مركز سوزان أطفال الكبد وفريد ​​(لRGW) وزمالة من شبكة الطفولة أمراض الكبد البحوث والتعليم (لSK).

يتم تنفيذ الإجراء بأكمله في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك. ينبغي تنفيذ جميع أعمال الحيوانية في ظل ظروف إنسانية في إطار بروتوكول وافقت عليها اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام المحلي (IACUC). 1. إعداد المعدات وحلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد جدول الجراحية الماوس في مقربة من نسيج الثقافة هود والحاضنة (الشكل 1A). ملاحظة: تشمل المعدات المطلوبة مجهر تشريح، مصدر الضوء، 12.5 سم مقص القزحية على التوالي، 6 بوصة ملقط المنحني غير مسننة مع نصائح غرامة، و 4 بوصة ملقط مسنن مع نصائح المنحنية (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأدوات المعقمة في كوب كوب من الكحول 70٪ على الطاولة الجراحية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء ثلاثة 60 ملم أطباق بتري معقمة مع وسائل الاعلام العزلة العقيمة (الجدول 1)؛ وضع اثنين على طاولة العمليات الجراحية وواحدة في غطاء محرك السيارة، كل على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الفئران الذيل الكولاجين،10X الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS)، الماء المعقم، المعقم 1 N هيدروكسيد الصوديوم والخلايا الظهارية الصفراوي (BEC) وسائل الاعلام (الجدول 1) في نسيج الثقافة هود. ملاحظة: يجب أن يكون الكولاجين على الجليد. </li></ol> 2. عزل القناة الصفراوية والثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفئران حديثي الولادة بين 0-3 أيام للحياة، من خلال التعرض لغاز ثاني أكسيد الكربون حتى يتبع اللاوعي من قبل خلع عنق الرحم، في المبادئ التوجيهية IACUC (الشكل 1C). ملاحظة: الفئران الأكبر سنا يمكن استخدامها تبعا للاحتياجات تجريبية محددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوان في موقف ضعيف وجعل شق أفقي صغير عبور خط الوسط في منطقة الحوض. توسيع هذا الشق أفقيا ويصل كلا الجانبين من البطن، وتشكيل رفرف U الشكل. بدوره رفرف تصل لفضح أعضاء البطن. مرة واحدة في البطن مفتوحا، تحرك بحذر الامعاء من تجويف البطن نحو الجانب الأيمن من الحيوان لرؤية أفضل من الكبد والقناة الصفراوية المشتركة. ملاحظة: قد يكون من الضروري لتوسيع الشقوق الجانبية في القفص الصدري للحصول على التعرف بشكل أفضل على الكبد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر تشريح، وتحديد القناة الصفراوية المشتركة، والكبد، والأمعاء. تحديد القناة الصفراوية المشتركة الأولى (الشكل 1D)، وذلك باستخدام الحذر، حيث أن الهياكل هي حساسة جدا. مع ملقط مسنن مسنن وغير نظيفة بدقة وسلخ النسيج الضام بما في ذلك الدهون المحيطة الصفراء. استخدام ملقط لعقد واحد القناة وغيرها لتنظيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام تقنية مماثلة لتنظيف المرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع القنوات تنظيفها والمرارة في طبق أول من وسائل الإعلام العزلة على الجليد. التدليك بلطف الهياكل مع ملقط مسنن غير بينما في وسائل الإعلام إلى مزيد من إزالة الأنسجة الضامة وإزالة الصفراء من المرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل القنوات والمرارة إلى الطبق الثاني من وسائل الإعلام العزلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد عزل مجاري الهواء والمرارة من 5 الحيوانات، ونقلقطع إلى طبق بيتري ثالث، في غطاء محرك السيارة. ملاحظة: إذا الخلايا هي أن تكون معزولة أكثر من 5 حيوانات، والقيام على دفعات، وذلك باستخدام حلول جديدة لكل مجموعة من الحيوانات 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المواد الهلامية الكولاجين سميكة في نسيج الثقافة هود: ملاحظة: يمكن استخدام أي طبق الحجم. طبق ثقافة 60 ملم مع الحجم النهائي من 3 مل الكولاجين لكل مجموعة من 5 الولدان يعمل بشكل جيد. وهذا ينبغي أن يكون مستعدا جديدة في وقت التضمين القنوات معزولة حديثا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الفئران الكولاجين ذيل، 10X العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS 10X)، DH 2 O معقمة، ومعقمة 1 N هيدروكسيد الصوديوم على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واضاف حساب كميات درهم 2 0، 10X PBS، هيدروكسيد الصوديوم، والكولاجين اللازمة لالهلام مع تركيز النهائي من 2 ملغ / مل الكولاجين في برنامج تلفزيوني 1X، وذلك باستخدام وبلغ حجم التداول 1 N هيدروكسيد الصوديوم يساوي 0.023 أضعاف حجم الكولاجين. ملاحظة: إذا تم استخدام مصدر بديل الكولاجين، اتبع إرشادات الشركة المصنعة لتحييد وتشكيل هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج معا درهم 2 0، 10X برنامج تلفزيوني، و1 N هيدروكسيد الصوديوم، ثم تضاف الكولاجين وماصة جيدا لضمان حتى الاختلاط. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد سميكة حل الكولاجين لهلام مثل الاتساق في درجة حرارة الغرفة، تضمين فورا القنوات في الكولاجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة لتمكين الكولاجين ليصلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد عزز الجل (يتغير لونها من الأبيض واضحة ل)، تراكب مع 3.5 مل من وسائل الإعلام BEC (الجدول 1)، واحتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الاعلام BEC 3 مرات في الأسبوع واستبدالها مع 3.5 مل سائل الإعلام الجديدة. </li></ol> 3. عزل الابتدائية Cholangiocytes من الهلام الكولاجين سميكة ملاحظة: في غضون 3 أسابيع، وسوف رقة من cholangiocytes (الخلايا مع نواة كبيرة تمتد مباشرة من القنوات جزءا لا يتجزأ) تكون مرئية في الكولاجين سميكة. إذا كانت هناك أعداد كبيرة من الخلايا الليفية في طبق، يجب التخلص منه. إذا كان عدد قليل من مناطق طبق ديكنمو الخلايا الليفية، ويمكن خفض هذه خارجا مع مشرط وإزالة قبل تقسيم cholangiocytes. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المواد الهلامية الكولاجين رقيقة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الكولاجين لتركيز 1 ملغ / مل مع برنامج تلفزيوني العقيمة. ملاحظة: استخدام 1 مل لمدة 100 مم لوحة؛ ضبط وفقا لحجم الأطباق الأخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نشر الحل الكولاجين بالتساوي مع رش الخلية (أطباق كبيرة) أو تلميح ماصة (أطباق صغيرة)، ثم ترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية لوحة مع DMEM/F12 واحتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة من الحاضنة ويغسل مع برنامج تلفزيوني 1X. نضح على الفور برنامج تلفزيوني 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف مع طبقة رقيقة الثاني من الكولاجين، ونشر عن طريق تناوب لوحة أو وضع لوحة على شاكر. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن عزز الكولاجين، لوحة الغلاف مع DMEM/F12 واحتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم الخلايا من الإك المواد الهلامية الكولاجين: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع ملعقة ثقافة الخلية أو مكشطة الخلية، وتتخلص من هلام الكولاجين بلطف من لوحة بحيث يتحرك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل كولاجيناز عن طريق تمييع نوع كولاجيناز الحادي عشر (انظر قائمة المواد) إلى 10 ملغ / مل مع DMEM/F12. تخلط جيدا وتصفية العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من محلول كولاجيناز (أعلاه) في 60 ملم طبق من الخلايا في الكولاجين سميكة. لا تقم بإزالة وسائل الإعلام BEC (التي ينبغي أن تكون 3 مل). احتضان الطبق لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة محلول يحتوي على الخلايا، ووضع في أنبوب 15 مل المخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار في 2،200 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف واعادة تعليق بيليه في حجم مماثل من DMEM/F12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور الحل مرة أخرى في 2200 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه resuspend في 3 مل من التربسين 0.5٪، واحتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 5 دقائق. بعد الحضانة، ماصة الحل صعودا وهبوطا لتفريق ورقة من cholangiocytes. إضافة 5 مل من BEC سائل الإعلامالحل الثاني تدور في 1،500 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف، و resuspend بيليه في DMEM/F12، ثم تدور حل في 1،500 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف واعادة تعليق بيليه في وسائل الإعلام BEC (الجدول 1). خلايا لوحة على المواد الهلامية التي سبق الكولاجين رقيقة. </li></ol></li></ol> 4. ممر وتخزين الخلايا ملاحظة: يمكن تقسيم الخلايا على المواد الهلامية الكولاجين رقيقة حسب الحاجة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأطباق مع برنامج تلفزيوني العقيمة قبل يحتضنها 0.25٪ التربسين عند 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحييد مع حجم مساو من وسائل الإعلام BEC، وبيليه في 1500 x ج لمدة 5 دقائق. شطف بيليه مع DMEM/F12، ثم بيليه في 1500 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام BEC لتوزيعها على الكولاجين المغلفة أطباق زراعة الخلايا. ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن أن الخلايا معلق في وسائط التخزين وتخزينها في الفريزر -80 ° C أو النيتروجين السائل (الجدول 1). </li></ol>

<ol>
	<li>Paradis, K., Sharp, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+duct-like+structure+formation+after+isolation+of+bile+ductular+cells+from+a+murine+model.">In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model.</a> J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).</li><li>Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+polarized+primary+cultures+of+rat+intrahepatic+bile+duct+epithelial+cells.">Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells.</a> Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).</li><li>Kumar, U., Jordan, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+biliary+epithelial+cells+from+the+biliary+tract+fraction+of+normal+rats.">Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats.</a> Liver. 6 (6), 369-378 (1986).</li><li>Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+morphologic+characterization+of+bile+duct+epithelial+cells+from+normal+rat+liver.">Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver.</a> Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).</li><li>Strazzabosco, M., Fabris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+bile+ducts:+Essentials+for+the+clinical+hepatologist.">Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist.</a> J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).</li><li>Carpentier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+ductal+plate+cells+give+rise+to+cholangiocytes,+periportal+hepatocytes,+and+adult+liver+progenitor+cells.">Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells.</a> Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).</li><li>Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+polarized+bile+duct+units+from+mouse+liver.">Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).</li><li>Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extra-hepatic+cholangiocyte+cilia+are+abnormal+in+biliary+atresia.">Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).</li><li>Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+human+extrahepatic+biliary+epithelium:+the+peribiliary+glands+as+progenitor+cell+compartment.">Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment.</a> Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).</li><li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stem/progenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes,+cholangiocytes,+and+pancreatic+islets.">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة.

الموصوفة هنا هي تقنية لعزل cholangiocytes نقية من القناة الصفراوية خارج الكبد من الفئران من الفئران من جميع الأعمار، بما في ذلك حديثي الولادة. تقدم هذه التقنية ميزة أن cholangiocytes خارج الكبد يمكن دراستها بمعزل عن cholangiocytes داخل الكبد، ويمكن أن تسهل دراسات لتحديد الاختلافات الرئ?...

أصل وتطور من داخل وخارج الكبد cholangiocytes تختلف بشكل ملحوظ. الكبد يتطور من رتج من المعى الأمامي الأديم الباطن بطني 5. المنطقة الذيلية من رتج تشكل الشجرة الصفراوية خارج الكبد، في حين أن المنطقة الجمجمة يولد الشجرة الصفراوية داخل الكبد 5. وتستمد cholangiocytes القناة داخل الكبد من الخلايا الاصلية في جميع أنحاء لوحة الأقنية في المناطق المحيطة البوابة 6. هذه الخلايا لديها القدرة على التمايز إلى خلايا الكبد أو إما cholangiocytes 6. هذا له آثار سريرية كبيرة بالنظر إلى أن cholangiopathies قد تستهدف على وجه التحديد فئة واحدة من cholangiocytes. على سبيل المثال، يؤثر رتق القناة الصفراوية خارج الكبد في البداية القنوات من حديثي الولادة، في حين Alagille متلازمة يؤثر القنوات داخل الكبد. هناك أوصاف متعددة من عزلة cholangiocytes داخل الكبد والقناة الصفراوية وحدات من الفئران والجرذان. فيvestigators عزلت الخلايا واحد عن طريق عزل مجاري الهواء وثمرة لاحقة، أو عن طريق الهضم والكبد الأجسام المضادة هدم من cholangiocytes معربا عن علامات محددة سطح الخلية 1-4. وقد تم عزل وحدات القناة الصفراوية الوظيفية والاستقطاب من قبل الهضم والكبد حجم الترشيح 7. وحدات القناة الصفراوية هي قادرة على الاستجابة للمحفزات إفرازية وإظهار إفراز السائل 7، في حين ثبت cholangiocytes معزولة لتطوير الهياكل ductular في المختبر 1،2. وتشمل القيود المفروضة على هذه الأساليب الحاجة إلى الخبرة الفنية المتخصصة ومعدات خاصة لنضح الكبد مع الإنزيمات الهضمية. بالإضافة إلى ذلك، هناك خطر التلوث مع خلايا اللحمة المتوسطة 3. وهناك طريقة لعزل خارج الكبد cholangiocytes القناة الصفراوية، وتحديدا من القناة الصفراوية خارج الكبد حديثي الولادة، لم يتم وصفه سابقا. توضح هذه الورقة تقنية مبسطة لعزل الأطفال حديثي الولادةق كذلك خلايا القناة الصفراوية خارج الكبد الكبار على مستويات عالية من النقاء. وهذه التقنية تسهيل دراسة الاختلافات بين cholangiocytes والبحث في آليات الأمراض مثل رتق القناة الصفراوية التي تنطوي على القنوات خارج الكبد داخل وخارج الكبد.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:943px;" width="942">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:323px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">DMEM/F12 (1:1)</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11320-033</td>
			<td>500ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">FBS</td>
			<td style="width:323px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11150</td>
			<td>25 ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MEM with non-essential amino acids</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11140-019</td>
			<td>5 ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Insulin-transferrin-selenium</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">51300-044</td>
			<td>5 ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Na Pyruvate</td>
			<td style="width:323px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">25-000-CL</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Chemically-defined lipid concentrate</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11905-031</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:323px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">30-002-CI</td>
			<td>5ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15750-060</td>
			<td>0.2ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E9508-100ml</td>
			<td>0.13ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MEM vitamin solution</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11120-052</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:323px;">Biowhittaker</td>
			<td style="width:119px;">17-605E</td>
			<td>5ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5mg/ml stock concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:323px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">25-005-CL</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Bovine pituitary extract</td>
			<td style="width:323px;">Gemini</td>
			<td style="width:119px;">500-102</td>
			<td>1.1ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D4902</td>
			<td>0.5ml, used in BEC media, Stock conc 393ug/ml dilute with ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">3 3&#39;,5-triiodo-L-thyronine</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6397</td>
			<td>0.5ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Epidermal growth factor</td>
			<td style="width:323px;">millipore</td>
			<td style="width:119px;">01-101</td>
			<td>0.5ml, used in BEC media, 25ug/ml dilute with DMEM F12+1%BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Forskolin</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F6886</td>
			<td>5ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411mg/ml and dilute with DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Fungizone</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15290-018</td>
			<td>1ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Rat-tail collagen</td>
			<td style="width:323px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">354236</td>
			<td>variable depending on concentration of collagen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">PBS 10X</td>
			<td style="width:323px;">USB Corporation</td>
			<td align="right" style="width:119px;">75889</td>
			<td>use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">dH2O</td>
			<td style="width:323px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">NaOH 10N</td>
			<td style="width:323px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ss255-1</td>
			<td>Dilute to 1N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">collagenase type XI from Clostridium histolyticum</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C7657</td>
			<td>dilute in DMEM and sterile filter before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">trypsin-EDTA (1x) 0.25%</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td>3 ml, incubate max 10 minutes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">trypsin-EDTA (10x) 0.5%</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15400-054</td>
			<td>3 ml, incubate max 10 minutes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;"></td>
			<td style="width:323px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:323px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645</td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Light source (fiberoptic illuminator)</td>
			<td style="width:323px;">Schott-Fostec</td>
			<td style="width:119px;">Ace EKE LR 92240</td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">12.5 cm straight iris scissors</td>
			<td style="width:323px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">6&#34; non-serrated curved forceps with fine tips</td>
			<td style="width:323px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">4&#34; serrated stainless forceps with fine tips</td>
			<td style="width:323px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes

القناة الصفراوية خارج الكبد وداخل الكبد تختلف تنمويا، ويمكن أن تتأثر بشكل مختلف عن أمراض معينة. ومع ذلك، فإن الاختلافات بين cholangiocytes داخل وخارج الكبد، وبين الخلايا حديثي الولادة والكبار، ليست مفهومة جيدا. طرق لعزل cholangiocytes القناة الصفراوية داخل الكبد من راسخة 1-4. عزل خلايا الأقنية خارج الكبد، خصوصا من حديثي الولادة، لم يتم بعد وصفها، على الرغم من أن هذا من شأنه أن تكون ذات فائدة كبيرة في فهم الاختلافات بين السكان cholangiocyte متميزة في دراسة والأمراض مثل رتق القناة الصفراوية التي يبدو أنها تستهدف القنوات خارج الكبد. الموصوفة هنا هو أسلوب الأمثل لعزل الخلايا القناة الصفراوية خارج الكبد على حد سواء حديثي الولادة والكبار الماوس. هذه التقنية تعطي السكان الخلية نقية مع الحد الأدنى من التلوث من خلايا اللحمة المتوسطة مثل الخلايا الليفية. هذا methoويستند د على إزالة القنوات خارج الكبد والمرارة، تليها تشريح دقيق وتجريف لإزالة طبقات الدهون والخلايا الليفية. هي جزء لا يتجزأ الهياكل في طبقات سميكة من الكولاجين وتربيتها لمدة ما يقرب من 3 أسابيع للسماح ثمرة cholangiocytes في الطبقات الوحيدة، التي يمكن بعد ذلك إعادة trypsinized ومطلي للاستخدام التجريبي.

استخدام هذا البروتوكول النتائج في عزل السكان من الأطفال حديثي الولادة الماوس cholangiocytes خارج الكبد مع نقاء ممتازة، كما يتبين من K19 المناعي تلطيخ (أرقام 2A و 2B)؛ نحقق نتائج مماثلة عزل خلايا من فئران بالغة. وقد لاحظنا أن يستغرق 3 أسابيع لخلايا من القناة الصفراوية ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes at JoVE.com

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

يوصف تقنية لعزل cholangiocytes من القناة الصفراوية خارج الكبد من الفئران حديثي الولادة. يتم تشريح بدقة القنوات، ثم يتم عزل الخلايا عن طريق ثمرة في المواد الهلامية الكولاجين سميكة. وهذه الطريقة توفر أداة مفيدة لدراسة خارج الكبد الصفراء تطوير القناة وعلم الأمراض.

عزل الأطفال حديثي الولادة خارج الكبد Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

isolation-of-neonatal-extrahepatic-cholangiocytes

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K Views.  The Children's Hospital of Philadelphia.  يوصف تقنية لعزل cholangiocytes من القناة الصفراوية خارج الكبد من الفئران حديثي الولادة. يتم تشريح بدقة القنوات، ثم يتم عزل الخلايا عن طريق ثمرة في المواد الهلامية الكولاجين سميكة. وهذه الطريقة توفر أداة مفيدة لدراسة خارج الكبد الصفراء تطوير القن...

Video: Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

عزل الخلايا البطانية صمامي

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

العزلة والثقافة في الخلايا البطانية الرئوي من الفئران حديثي الولادة

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

عزلة ذبابة الفاكهة السوداء البطن الخصيات

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

العزلة وثقافة الأطفال حديثي الولادة ماوس العضلية

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

عزل الشريان الرئوي خلايا العضلات الملساء من الفئران حديثي الولادة

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single procedure. Due to advances in microscope technology it is relatively easy to capture live cell images for the purpose of investigating cellular events in real time with minimal concern regarding phototoxicity to the cells. This protocol describes how to take live cell timelapse images of primary rat neonatal cardiomyocytes using a confocal spinning disk microscope following lentiviral and adenoviral transduction to modulate properties of the cell. The application of two different types of viruses makes it easier to achieve an appropriate transduction rate and expression levels for two different genes. Well focused live cell images can be obtained using the microscope&#8217;s autofocus system, which maintains stable focus for long time periods. Applying this method, the functions of exogenously engineered proteins expressed in cultured primary cells can be analyzed. Additionally, this system can be used to examine the functions of genes through the use of siRNAs as well as of chemical modulators.

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

يعيش التصوير خلية من فأر الابتدائية حديثي الولادة العضلية بعد الغدانية وLentiviral تنبيغ طريق متحد البؤر المجهري القرص الغزل

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.

الحقن في الوريد في الفئران حديثي الولادة

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

عزل وثقافة الكرياتينية الماوس الرئيسية من حديثي الولادة والفأر الكبار الجلد

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through megakaryopoiesis. The final stages of this process are complex and classically involve the bipotent Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitors (MEP) and the unipotent Megakaryocyte Progenitors (MKp). These populations precede the formation of bona fide megakaryocytes and, as such, their isolation and characterization could allow for the robust and unbiased analysis of megakaryocyte formation. This protocol presents in detail the procedure to collect hematopoietic cells from mouse bone marrow, the enrichment of hematopoietic progenitors through magnetic depletion and finally a cell sorting strategy that yield highly purified MEP and MKp populations. First, bone marrow cells are collected from the femur, the tibia, and also the iliac crest, a bone that contains a high number of hematopoietic progenitors. The use of iliac crest bones drastically increases the total cell number obtained per mouse and thus contributes to a more ethical use of animals. A magnetic lineage depletion was optimized using 450 nm magnetic beads allowing a very efficient cell sorting by flow cytometry. Finally, the protocol presents the labeling and gating strategy for the sorting of the two highly purified megakaryocyte progenitor populations: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim) and MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9bright). This technique is easy to implement and provides enough cellular material to perform i) molecular characterization for a deeper knowledge of their identity and biology, ii) in vitro differentiation assays, that will provide a better understanding of the mechanisms of maturation of megakaryocytes, or iii) in vitro models of interaction with their microenvironment.

This method describes the purification by flow cytometry of MEP and MKp from mice femurs, tibias, and pelvic bones.

عزل السلف ميغاكاريوسيت الماوس

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

كشف النقاب عن التهاب المفاصل: استكشاف وظائف الخلايا الزليلية

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central roles in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. It is important to understand the functions of both cell populations to reveal the mechanisms underlying pathological progression and remission in inflammatory arthritis. In general, in vitro experimental conditions should mimic the in vivo environment as much as possible. Primary tissue-derived cells have been used in experiments characterizing synovial fibroblasts in arthritis. In contrast, in experiments investigating the biological functions of macrophages in inflammatory arthritis, cell lines, bone marrow-derived macrophages, and blood monocyte-derived macrophages have been used. However, it is unclear whether such macrophages actually reflect the functions of tissue-resident macrophages. To obtain resident macrophages, previous protocols were modified to isolate and expand both primary macrophages and fibroblasts from synovial tissue in an inflammatory arthritis mouse model. These primary synovial cells may be useful for in vitro analysis of inflammatory arthritis.

تسليط الضوء على المؤلف: عزل وثقافة الضامة الزليلية الأولية والخلايا الليفية من أنسجة التهاب المفاصل الفئران  

The present study provides a modified protocol to isolate synovial macrophages and fibroblasts from murine inflammatory arthritis tissue.

عزل وثقافة البلاعم الزليلية الأولية والخلايا الليفية من أنسجة التهاب المفاصل الفئران

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...