المؤلفون ممتنون لعلم الأمراض الجزيئية والتصوير الأساسية لمركز جامعة بنسلفانيا NIDDK للدراسات الجزيئية في أمراض الجهاز الهضمي والكبد (P30 DK50306) للحصول على المساعدة مع التصوير. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (R01 DK-092111) ومن Biesecker مركز سوزان أطفال الكبد وفريد ​​(لRGW) وزمالة من شبكة الطفولة أمراض الكبد البحوث والتعليم (لSK).

يتم تنفيذ الإجراء بأكمله في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك. ينبغي تنفيذ جميع أعمال الحيوانية في ظل ظروف إنسانية في إطار بروتوكول وافقت عليها اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام المحلي (IACUC). 1. إعداد المعدات وحلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد جدول الجراحية الماوس في مقربة من نسيج الثقافة هود والحاضنة (الشكل 1A). ملاحظة: تشمل المعدات المطلوبة مجهر تشريح، مصدر الضوء، 12.5 سم مقص القزحية على التوالي، 6 بوصة ملقط المنحني غير مسننة مع نصائح غرامة، و 4 بوصة ملقط مسنن مع نصائح المنحنية (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأدوات المعقمة في كوب كوب من الكحول 70٪ على الطاولة الجراحية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء ثلاثة 60 ملم أطباق بتري معقمة مع وسائل الاعلام العزلة العقيمة (الجدول 1)؛ وضع اثنين على طاولة العمليات الجراحية وواحدة في غطاء محرك السيارة، كل على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الفئران الذيل الكولاجين،10X الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS)، الماء المعقم، المعقم 1 N هيدروكسيد الصوديوم والخلايا الظهارية الصفراوي (BEC) وسائل الاعلام (الجدول 1) في نسيج الثقافة هود. ملاحظة: يجب أن يكون الكولاجين على الجليد. </li></ol> 2. عزل القناة الصفراوية والثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفئران حديثي الولادة بين 0-3 أيام للحياة، من خلال التعرض لغاز ثاني أكسيد الكربون حتى يتبع اللاوعي من قبل خلع عنق الرحم، في المبادئ التوجيهية IACUC (الشكل 1C). ملاحظة: الفئران الأكبر سنا يمكن استخدامها تبعا للاحتياجات تجريبية محددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوان في موقف ضعيف وجعل شق أفقي صغير عبور خط الوسط في منطقة الحوض. توسيع هذا الشق أفقيا ويصل كلا الجانبين من البطن، وتشكيل رفرف U الشكل. بدوره رفرف تصل لفضح أعضاء البطن. مرة واحدة في البطن مفتوحا، تحرك بحذر الامعاء من تجويف البطن نحو الجانب الأيمن من الحيوان لرؤية أفضل من الكبد والقناة الصفراوية المشتركة. ملاحظة: قد يكون من الضروري لتوسيع الشقوق الجانبية في القفص الصدري للحصول على التعرف بشكل أفضل على الكبد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر تشريح، وتحديد القناة الصفراوية المشتركة، والكبد، والأمعاء. تحديد القناة الصفراوية المشتركة الأولى (الشكل 1D)، وذلك باستخدام الحذر، حيث أن الهياكل هي حساسة جدا. مع ملقط مسنن مسنن وغير نظيفة بدقة وسلخ النسيج الضام بما في ذلك الدهون المحيطة الصفراء. استخدام ملقط لعقد واحد القناة وغيرها لتنظيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام تقنية مماثلة لتنظيف المرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع القنوات تنظيفها والمرارة في طبق أول من وسائل الإعلام العزلة على الجليد. التدليك بلطف الهياكل مع ملقط مسنن غير بينما في وسائل الإعلام إلى مزيد من إزالة الأنسجة الضامة وإزالة الصفراء من المرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل القنوات والمرارة إلى الطبق الثاني من وسائل الإعلام العزلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد عزل مجاري الهواء والمرارة من 5 الحيوانات، ونقلقطع إلى طبق بيتري ثالث، في غطاء محرك السيارة. ملاحظة: إذا الخلايا هي أن تكون معزولة أكثر من 5 حيوانات، والقيام على دفعات، وذلك باستخدام حلول جديدة لكل مجموعة من الحيوانات 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المواد الهلامية الكولاجين سميكة في نسيج الثقافة هود: ملاحظة: يمكن استخدام أي طبق الحجم. طبق ثقافة 60 ملم مع الحجم النهائي من 3 مل الكولاجين لكل مجموعة من 5 الولدان يعمل بشكل جيد. وهذا ينبغي أن يكون مستعدا جديدة في وقت التضمين القنوات معزولة حديثا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الفئران الكولاجين ذيل، 10X العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS 10X)، DH 2 O معقمة، ومعقمة 1 N هيدروكسيد الصوديوم على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واضاف حساب كميات درهم 2 0، 10X PBS، هيدروكسيد الصوديوم، والكولاجين اللازمة لالهلام مع تركيز النهائي من 2 ملغ / مل الكولاجين في برنامج تلفزيوني 1X، وذلك باستخدام وبلغ حجم التداول 1 N هيدروكسيد الصوديوم يساوي 0.023 أضعاف حجم الكولاجين. ملاحظة: إذا تم استخدام مصدر بديل الكولاجين، اتبع إرشادات الشركة المصنعة لتحييد وتشكيل هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج معا درهم 2 0، 10X برنامج تلفزيوني، و1 N هيدروكسيد الصوديوم، ثم تضاف الكولاجين وماصة جيدا لضمان حتى الاختلاط. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد سميكة حل الكولاجين لهلام مثل الاتساق في درجة حرارة الغرفة، تضمين فورا القنوات في الكولاجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة لتمكين الكولاجين ليصلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد عزز الجل (يتغير لونها من الأبيض واضحة ل)، تراكب مع 3.5 مل من وسائل الإعلام BEC (الجدول 1)، واحتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الاعلام BEC 3 مرات في الأسبوع واستبدالها مع 3.5 مل سائل الإعلام الجديدة. </li></ol> 3. عزل الابتدائية Cholangiocytes من الهلام الكولاجين سميكة ملاحظة: في غضون 3 أسابيع، وسوف رقة من cholangiocytes (الخلايا مع نواة كبيرة تمتد مباشرة من القنوات جزءا لا يتجزأ) تكون مرئية في الكولاجين سميكة. إذا كانت هناك أعداد كبيرة من الخلايا الليفية في طبق، يجب التخلص منه. إذا كان عدد قليل من مناطق طبق ديكنمو الخلايا الليفية، ويمكن خفض هذه خارجا مع مشرط وإزالة قبل تقسيم cholangiocytes. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المواد الهلامية الكولاجين رقيقة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الكولاجين لتركيز 1 ملغ / مل مع برنامج تلفزيوني العقيمة. ملاحظة: استخدام 1 مل لمدة 100 مم لوحة؛ ضبط وفقا لحجم الأطباق الأخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نشر الحل الكولاجين بالتساوي مع رش الخلية (أطباق كبيرة) أو تلميح ماصة (أطباق صغيرة)، ثم ترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية لوحة مع DMEM/F12 واحتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة من الحاضنة ويغسل مع برنامج تلفزيوني 1X. نضح على الفور برنامج تلفزيوني 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف مع طبقة رقيقة الثاني من الكولاجين، ونشر عن طريق تناوب لوحة أو وضع لوحة على شاكر. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن عزز الكولاجين، لوحة الغلاف مع DMEM/F12 واحتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم الخلايا من الإك المواد الهلامية الكولاجين: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع ملعقة ثقافة الخلية أو مكشطة الخلية، وتتخلص من هلام الكولاجين بلطف من لوحة بحيث يتحرك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل كولاجيناز عن طريق تمييع نوع كولاجيناز الحادي عشر (انظر قائمة المواد) إلى 10 ملغ / مل مع DMEM/F12. تخلط جيدا وتصفية العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من محلول كولاجيناز (أعلاه) في 60 ملم طبق من الخلايا في الكولاجين سميكة. لا تقم بإزالة وسائل الإعلام BEC (التي ينبغي أن تكون 3 مل). احتضان الطبق لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة محلول يحتوي على الخلايا، ووضع في أنبوب 15 مل المخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار في 2،200 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف واعادة تعليق بيليه في حجم مماثل من DMEM/F12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور الحل مرة أخرى في 2200 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه resuspend في 3 مل من التربسين 0.5٪، واحتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 5 دقائق. بعد الحضانة، ماصة الحل صعودا وهبوطا لتفريق ورقة من cholangiocytes. إضافة 5 مل من BEC سائل الإعلامالحل الثاني تدور في 1،500 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف، و resuspend بيليه في DMEM/F12، ثم تدور حل في 1،500 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف واعادة تعليق بيليه في وسائل الإعلام BEC (الجدول 1). خلايا لوحة على المواد الهلامية التي سبق الكولاجين رقيقة. </li></ol></li></ol> 4. ممر وتخزين الخلايا ملاحظة: يمكن تقسيم الخلايا على المواد الهلامية الكولاجين رقيقة حسب الحاجة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأطباق مع برنامج تلفزيوني العقيمة قبل يحتضنها 0.25٪ التربسين عند 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحييد مع حجم مساو من وسائل الإعلام BEC، وبيليه في 1500 x ج لمدة 5 دقائق. شطف بيليه مع DMEM/F12، ثم بيليه في 1500 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام BEC لتوزيعها على الكولاجين المغلفة أطباق زراعة الخلايا. ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن أن الخلايا معلق في وسائط التخزين وتخزينها في الفريزر -80 ° C أو النيتروجين السائل (الجدول 1). </li></ol>

<ol>
	<li>Paradis, K., Sharp, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+duct-like+structure+formation+after+isolation+of+bile+ductular+cells+from+a+murine+model.">In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model.</a> J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).</li><li>Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+polarized+primary+cultures+of+rat+intrahepatic+bile+duct+epithelial+cells.">Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells.</a> Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).</li><li>Kumar, U., Jordan, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+biliary+epithelial+cells+from+the+biliary+tract+fraction+of+normal+rats.">Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats.</a> Liver. 6 (6), 369-378 (1986).</li><li>Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+morphologic+characterization+of+bile+duct+epithelial+cells+from+normal+rat+liver.">Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver.</a> Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).</li><li>Strazzabosco, M., Fabris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+bile+ducts:+Essentials+for+the+clinical+hepatologist.">Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist.</a> J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).</li><li>Carpentier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+ductal+plate+cells+give+rise+to+cholangiocytes,+periportal+hepatocytes,+and+adult+liver+progenitor+cells.">Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells.</a> Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).</li><li>Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+polarized+bile+duct+units+from+mouse+liver.">Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).</li><li>Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extra-hepatic+cholangiocyte+cilia+are+abnormal+in+biliary+atresia.">Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).</li><li>Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+human+extrahepatic+biliary+epithelium:+the+peribiliary+glands+as+progenitor+cell+compartment.">Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment.</a> Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).</li><li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stem/progenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes,+cholangiocytes,+and+pancreatic+islets.">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة.

الموصوفة هنا هي تقنية لعزل cholangiocytes نقية من القناة الصفراوية خارج الكبد من الفئران من الفئران من جميع الأعمار، بما في ذلك حديثي الولادة. تقدم هذه التقنية ميزة أن cholangiocytes خارج الكبد يمكن دراستها بمعزل عن cholangiocytes داخل الكبد، ويمكن أن تسهل دراسات لتحديد الاختلافات الرئ?...

أصل وتطور من داخل وخارج الكبد cholangiocytes تختلف بشكل ملحوظ. الكبد يتطور من رتج من المعى الأمامي الأديم الباطن بطني 5. المنطقة الذيلية من رتج تشكل الشجرة الصفراوية خارج الكبد، في حين أن المنطقة الجمجمة يولد الشجرة الصفراوية داخل الكبد 5. وتستمد cholangiocytes القناة داخل الكبد من الخلايا الاصلية في جميع أنحاء لوحة الأقنية في المناطق المحيطة البوابة 6. هذه الخلايا لديها القدرة على التمايز إلى خلايا الكبد أو إما cholangiocytes 6. هذا له آثار سريرية كبيرة بالنظر إلى أن cholangiopathies قد تستهدف على وجه التحديد فئة واحدة من cholangiocytes. على سبيل المثال، يؤثر رتق القناة الصفراوية خارج الكبد في البداية القنوات من حديثي الولادة، في حين Alagille متلازمة يؤثر القنوات داخل الكبد. هناك أوصاف متعددة من عزلة cholangiocytes داخل الكبد والقناة الصفراوية وحدات من الفئران والجرذان. فيvestigators عزلت الخلايا واحد عن طريق عزل مجاري الهواء وثمرة لاحقة، أو عن طريق الهضم والكبد الأجسام المضادة هدم من cholangiocytes معربا عن علامات محددة سطح الخلية 1-4. وقد تم عزل وحدات القناة الصفراوية الوظيفية والاستقطاب من قبل الهضم والكبد حجم الترشيح 7. وحدات القناة الصفراوية هي قادرة على الاستجابة للمحفزات إفرازية وإظهار إفراز السائل 7، في حين ثبت cholangiocytes معزولة لتطوير الهياكل ductular في المختبر 1،2. وتشمل القيود المفروضة على هذه الأساليب الحاجة إلى الخبرة الفنية المتخصصة ومعدات خاصة لنضح الكبد مع الإنزيمات الهضمية. بالإضافة إلى ذلك، هناك خطر التلوث مع خلايا اللحمة المتوسطة 3. وهناك طريقة لعزل خارج الكبد cholangiocytes القناة الصفراوية، وتحديدا من القناة الصفراوية خارج الكبد حديثي الولادة، لم يتم وصفه سابقا. توضح هذه الورقة تقنية مبسطة لعزل الأطفال حديثي الولادةق كذلك خلايا القناة الصفراوية خارج الكبد الكبار على مستويات عالية من النقاء. وهذه التقنية تسهيل دراسة الاختلافات بين cholangiocytes والبحث في آليات الأمراض مثل رتق القناة الصفراوية التي تنطوي على القنوات خارج الكبد داخل وخارج الكبد.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:943px;" width="942">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:323px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">DMEM/F12 (1:1)</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11320-033</td>
			<td>500ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">FBS</td>
			<td style="width:323px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11150</td>
			<td>25 ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MEM with non-essential amino acids</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11140-019</td>
			<td>5 ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Insulin-transferrin-selenium</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">51300-044</td>
			<td>5 ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Na Pyruvate</td>
			<td style="width:323px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">25-000-CL</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Chemically-defined lipid concentrate</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11905-031</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:323px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">30-002-CI</td>
			<td>5ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15750-060</td>
			<td>0.2ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E9508-100ml</td>
			<td>0.13ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MEM vitamin solution</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11120-052</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:323px;">Biowhittaker</td>
			<td style="width:119px;">17-605E</td>
			<td>5ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5mg/ml stock concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:323px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">25-005-CL</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Bovine pituitary extract</td>
			<td style="width:323px;">Gemini</td>
			<td style="width:119px;">500-102</td>
			<td>1.1ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D4902</td>
			<td>0.5ml, used in BEC media, Stock conc 393ug/ml dilute with ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">3 3&#39;,5-triiodo-L-thyronine</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6397</td>
			<td>0.5ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Epidermal growth factor</td>
			<td style="width:323px;">millipore</td>
			<td style="width:119px;">01-101</td>
			<td>0.5ml, used in BEC media, 25ug/ml dilute with DMEM F12+1%BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Forskolin</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F6886</td>
			<td>5ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411mg/ml and dilute with DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Fungizone</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15290-018</td>
			<td>1ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Rat-tail collagen</td>
			<td style="width:323px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">354236</td>
			<td>variable depending on concentration of collagen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">PBS 10X</td>
			<td style="width:323px;">USB Corporation</td>
			<td align="right" style="width:119px;">75889</td>
			<td>use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">dH2O</td>
			<td style="width:323px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">NaOH 10N</td>
			<td style="width:323px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ss255-1</td>
			<td>Dilute to 1N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">collagenase type XI from Clostridium histolyticum</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C7657</td>
			<td>dilute in DMEM and sterile filter before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">trypsin-EDTA (1x) 0.25%</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td>3 ml, incubate max 10 minutes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">trypsin-EDTA (10x) 0.5%</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15400-054</td>
			<td>3 ml, incubate max 10 minutes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;"></td>
			<td style="width:323px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:323px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645</td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Light source (fiberoptic illuminator)</td>
			<td style="width:323px;">Schott-Fostec</td>
			<td style="width:119px;">Ace EKE LR 92240</td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">12.5 cm straight iris scissors</td>
			<td style="width:323px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">6&#34; non-serrated curved forceps with fine tips</td>
			<td style="width:323px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">4&#34; serrated stainless forceps with fine tips</td>
			<td style="width:323px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes

القناة الصفراوية خارج الكبد وداخل الكبد تختلف تنمويا، ويمكن أن تتأثر بشكل مختلف عن أمراض معينة. ومع ذلك، فإن الاختلافات بين cholangiocytes داخل وخارج الكبد، وبين الخلايا حديثي الولادة والكبار، ليست مفهومة جيدا. طرق لعزل cholangiocytes القناة الصفراوية داخل الكبد من راسخة 1-4. عزل خلايا الأقنية خارج الكبد، خصوصا من حديثي الولادة، لم يتم بعد وصفها، على الرغم من أن هذا من شأنه أن تكون ذات فائدة كبيرة في فهم الاختلافات بين السكان cholangiocyte متميزة في دراسة والأمراض مثل رتق القناة الصفراوية التي يبدو أنها تستهدف القنوات خارج الكبد. الموصوفة هنا هو أسلوب الأمثل لعزل الخلايا القناة الصفراوية خارج الكبد على حد سواء حديثي الولادة والكبار الماوس. هذه التقنية تعطي السكان الخلية نقية مع الحد الأدنى من التلوث من خلايا اللحمة المتوسطة مثل الخلايا الليفية. هذا methoويستند د على إزالة القنوات خارج الكبد والمرارة، تليها تشريح دقيق وتجريف لإزالة طبقات الدهون والخلايا الليفية. هي جزء لا يتجزأ الهياكل في طبقات سميكة من الكولاجين وتربيتها لمدة ما يقرب من 3 أسابيع للسماح ثمرة cholangiocytes في الطبقات الوحيدة، التي يمكن بعد ذلك إعادة trypsinized ومطلي للاستخدام التجريبي.

استخدام هذا البروتوكول النتائج في عزل السكان من الأطفال حديثي الولادة الماوس cholangiocytes خارج الكبد مع نقاء ممتازة، كما يتبين من K19 المناعي تلطيخ (أرقام 2A و 2B)؛ نحقق نتائج مماثلة عزل خلايا من فئران بالغة. وقد لاحظنا أن يستغرق 3 أسابيع لخلايا من القناة الصفراوية ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes at JoVE.com

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

يوصف تقنية لعزل cholangiocytes من القناة الصفراوية خارج الكبد من الفئران حديثي الولادة. يتم تشريح بدقة القنوات، ثم يتم عزل الخلايا عن طريق ثمرة في المواد الهلامية الكولاجين سميكة. وهذه الطريقة توفر أداة مفيدة لدراسة خارج الكبد الصفراء تطوير القناة وعلم الأمراض.

عزل الأطفال حديثي الولادة خارج الكبد Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

isolation-of-neonatal-extrahepatic-cholangiocytes

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K Views.  The Children's Hospital of Philadelphia.  يوصف تقنية لعزل cholangiocytes من القناة الصفراوية خارج الكبد من الفئران حديثي الولادة. يتم تشريح بدقة القنوات، ثم يتم عزل الخلايا عن طريق ثمرة في المواد الهلامية الكولاجين سميكة. وهذه الطريقة توفر أداة مفيدة لدراسة خارج الكبد الصفراء تطوير القن...

Video: Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response. Due to their key role in inflammation, neutrophil functions such as locomotion, cytokine production, phagocytosis, and tumor cell combat are extensively studied. To characterize the specific functions of neutrophils, a clean, fast, and reliable method of separating them from other blood cells is desirable for in vitro studies, especially since neutrophils are short-lived and should be used within 2-4 hours of collection. Here, we demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media that is a mixture of sodium metrizoate and Dextran 500. The procedure consists of layering whole blood over the density gradient medium, centrifugation, separation of neutrophil layer, and lysis of residual erythrocytes. Cells are then washed, counted, and resuspended in buffer to desired concentration. When performed correctly, this method has been shown to yield samples of >95% neutrophils with >95% viability.

Neutrophils are among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response, and their functions and mechanisms have been studied extensively in vitro. We demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media.

العدلة عزل بروتوكول

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and abiotic stresses and also regulates water flow from the external environment.1 A biopolyester (cutin) and long-chain fatty acids (waxes) form the principal structural framework of the cuticle; the functional integrity of the cuticular layer depends on the outer 'epicuticular' layer as well as the blend consisting of the cutin biopolymer and 'intracuticular' waxes.2 Herein, we describe a comprehensive protocol to extract waxes exhaustively from commercial tomato (Solanum lycopersicum) fruit cuticles or to remove epicuticular and intracuticular waxes sequentially and selectively from the cuticle composite. The method of Jetter and Sch&auml;ffer (2001) was adapted for the stepwise extraction of epicuticular and intracuticular waxes from the fruit cuticle.3,4 To monitor the process of sequential wax removal, solid-state cross-polarization magic-angle-spinning (CPMAS) 13C NMR spectroscopy was used in parallel with atomic force microscopy (AFM), providing molecular-level structural profiles of the bulk materials complemented by information on the microscale topography and roughness of the cuticular surfaces. To evaluate the cross-linking capabilities of dewaxed cuticles from cultivated wild-type and single-gene mutant tomato fruits, MAS 13C NMR was used to compare the relative proportions of oxygenated aliphatic (CHO and CH2O) chemical moieties.
Exhaustive dewaxing by stepwise Soxhlet extraction with a panel of solvents of varying polarity provides an effective means to isolate wax moieties based on the hydrophobic characteristics of their aliphatic and aromatic constituents, while preserving the chemical structure of the cutin biopolyester. The mechanical extraction of epicuticular waxes and selective removal of intracuticular waxes, when monitored by complementary physical methodologies, provides an unprecedented means to investigate the cuticle assembly: this approach reveals the supramolecular organization and structural integration of various types of waxes, the architecture of the cutin-wax matrix, and the chemical composition of each constituent. In addition, solid-state 13C NMR reveals differences in the relative numbers of CHO and CH2O chemical moieties for wild-type and mutant red ripe tomato fruits. The NMR techniques offer exceptional tools to fingerprint the molecular structure of cuticular materials that are insoluble, amorphous, and chemically heterogeneous. As a noninvasive surface-selective imaging technique, AFM furnishes an effective and direct means to probe the structural organization of the cuticular assembly on the nm-&mu;m length scale.

Aerial plant organs are protected by the cuticle, a supramolecular biopolyester-wax assembly. We present protocols to monitor selective removal of epi- and intracuticular waxes from tomato fruit cuticles on molecular and micro scales by solid-state NMR and atomic force microscopy, respectively, and to assess the cross-linking capacity of engineered cuticular biopolyesters.

العزلة ودراسة البيوفيزيائية البشرة من الفاكهة

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

عزل الخلايا المناعية من الأورام الأولية

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

العزلة وثقافة الأطفال حديثي الولادة ماوس العضلية

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

عزلة الجنينية البطيني الخلايا البطانية

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

عزل الشريان الرئوي خلايا العضلات الملساء من الفئران حديثي الولادة

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single procedure. Due to advances in microscope technology it is relatively easy to capture live cell images for the purpose of investigating cellular events in real time with minimal concern regarding phototoxicity to the cells. This protocol describes how to take live cell timelapse images of primary rat neonatal cardiomyocytes using a confocal spinning disk microscope following lentiviral and adenoviral transduction to modulate properties of the cell. The application of two different types of viruses makes it easier to achieve an appropriate transduction rate and expression levels for two different genes. Well focused live cell images can be obtained using the microscope&#8217;s autofocus system, which maintains stable focus for long time periods. Applying this method, the functions of exogenously engineered proteins expressed in cultured primary cells can be analyzed. Additionally, this system can be used to examine the functions of genes through the use of siRNAs as well as of chemical modulators.

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

يعيش التصوير خلية من فأر الابتدائية حديثي الولادة العضلية بعد الغدانية وLentiviral تنبيغ طريق متحد البؤر المجهري القرص الغزل

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

عزل خلايا الفئران صمام غشائي

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.

الحقن في الوريد في الفئران حديثي الولادة

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

عزل خلايا الفأر التاجي غشائي

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...