وقد افتقر حقل الحويصلات خارج الخلية إلى نموذج اللافقاريات القابلة للخلود وراثياً لدراسة إشارات البروتين والرنا من الحويصلات خارج الخلية. هذا البروتوكول يؤسس أساليب الحصول على وفيرة، حويصلات خارج الخلية نقية من C.elegans. وهذا يكفي لتحليل RNA-SEQ والبروتيوم القوي.
عندما تكون الثقافة المتزامنة C.elegans قد استنفدت الغذاء من لوحة متوسطة النمو الطبيعي، واستخدام العصابات المطاطية لتأمين خمسة ميكرومتر مرشح شبكة نايلون غطاء على زجاجة معقمة والبدء في فراغ. صب الديدان L1 على المرشح وتمرير وحدة تخزين متساوية من المتوسط على المجاميع دودة. بعد دوامة، نقل ثلاثة 10 ميكرولتر مجلدات من تعليق دودة على غطاء لوحة زراعة دودة وعدد الحيوانات في كل قطرة.
ضبط تعليق دودة إلى اثنين من الحيوانات لكل ميكرولتر من المتوسطة الطازجة ودوامة تعليق مرة أخرى. بعد ذلك ، أضف تسعة ، 10 قطرات ميكرولتر من الديدان على غطاء لوحة جديدة ، وتحسب يدويا عدد الحيوانات في كل قطرة. ثم حساب متوسط والخطأ القياسي للمتوسط كنسبة مئوية من كل مجموعة من الديدان وحساب العدد الإجمالي للحيوانات في كل مجموعة.
لإعداد الديدان لتوليد إفرازات، وغسل الديدان مع ثلاثة يغسل خمس دقائق في 15 ملليلتر من M9 المتوسطة العقيمة مع 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من كاربينسيلين لكل لوحة في غسل مع دوامة لطيف لإزاحة الديدان، وتجميع يغسل في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. بعد الغسيل الأخير، تمييع الديدان إلى واحد لكل ميكرولتر من محلول S-Basel مكمّل بـ 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر من الكوليسترول و50 تركيز كربنيسيلين ميكرومولار. ثم إضافة ما يصل إلى 400 ملليلتر من تعليق دودة إلى قارورة معقمتين قاع لترين في حيرة.
ضع القارورة على دوار دائري عند 20 درجة مئوية و 100 دوران في الدقيقة لمدة 24 ساعة. بالنسبة لحصاد الحويضات خارج الخلية، قم بنقل الديدان في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر للطرد المركزي و ديسانت الماذر من خلال فلتر فراغ 0.22 ميكرومتر لإزالة أي حطام جسيمات. بعد العد، ضع قطرة من الديدان المعلقة على حديقة بكتيرية وسجل الحيوانات على أنها تتحرك أو مشلولة أو ميتة بعد 15 دقيقة.
المقبل، والتركيز على السوبر المصفاة إلى 700 ميكرولترات مع نيتروسيلولوز تجديد 10 كيلودالتون الجزيئية خفض الوزن مرشح وإضافة 150 ميكرولترات من حل S بازل الطازجة للحد. تصفية ودوامة الحل الناتج وتكرار التخفيض والترشيح مرتين أكثر كما هو موضح للتو. بعد الترشيح الأخير، الطرد المركزي فائق لإزالة أي الجزيئات والحطام التي قد تراكمت أثناء المناولة وإضافة كوكتيل مثبطات البروتياز بالإضافة إلى EDTA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
لإعداد عمود استبعاد الحجم، decant 15 ملليلتر من الراتنج agarose مع وقف التنفيذ في خرطوشة عمود تدفق الجاذبية الفارغة. عندما ينضب العمود، إضافة محلول S-بازل حتى يتم حزم سرير الراتنج في حجم النهائي من 10 ملليلتر. استبدال العازلة الراتنج مع 40 ملليلتر من محلول S-بازل معقم المصفاة، مع الحرص على عدم إزعاج الراتنج، والسماح للجاذبية لاستنزاف العازلة من خلال العمود.
مرة واحدة في الجزء العلوي من الراتنج لم يعد مغمورة، قبعة الجزء السفلي من خرطوشة لوقف تدفق ووضع أنبوب جمع تحت العمود. لبدء تجزئة إفرازات، وإزالة الغطاء وإضافة فورا حل secretome المركزة قطرة الحكمة إلى الجزء العلوي من السرير العمود، تليها إضافة ملليلتر واحد من حل S-بازل قطرة الحكمة. ضع أنبوب جمع جديد تحت العمود وملء خزان العمود العلوي ببطء بخمسة ملليلترات من محلول S-Basel.
بعد جمع أول ملليلترين من الزاوي، بسرعة تغيير الأنابيب لجمع المليلتر الأربعة المقبلة. استخدام nitrocellulose مجددة 10 كيلودالتون الجزيئية خفض الوزن الجزيئية خفض فلتر الدوران لتركيز في vesicle خارج الخلية التي تحتوي على مسيل العمود إلى 300 microliters ونقل إعادة فلتر إلى انخفاض ربط microcentrifuge أنبوب. ثم غسل غشاء مرشح مرتين مع 100 ميكرولترات من محلول S-بازل في 20 ثانية من دوامة لكل غسل والجمع بين يغسل مع إعادة الأصلي لحجم العينة النهائية من 500 ميكرولترات.
لإعداد العويصلات خارج الخلية للقياس الكمي عن طريق تحليل التدفق الخلوي، أضف 840 ميكرولترات من محلول S-Basel و60 ميكرولترات من العويصلات الخارجية النقية إلى أنبوب ميكروفيرج. إضافة 300 ميكرولترات من العينة في اثنين من أنابيب microcentuge إضافية جنبا إلى جنب مع سبعة ميكرولترات من المسبار القوي المناسب لكل أنبوب. إضافة سبعة ميكروليتر من 1٪ تريتون X-100 إلى أنبوب الماضي وخلط جميع الأنابيب عن طريق دوامة.
وضع طرف sonicator في وسط أنبوب العينة الثالثة ونبض العينة 10 مرات في 20 ٪ والسلطة ودورة 30 ٪ واجب. المقبل، إضافة 300 ميكرولترات من حل S-بازل لاثنين من أنابيب التحكم microcentrifuge وإضافة سبعة ميكرولترات من المسبار إلى أنبوب صبغ فقط. تسمية الأنبوب الثاني المخزن المؤقت فقط.
ثم احتضان جميع الأنابيب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء قبل تحليلها عن طريق تدفق cytometry وفقا للبروتوكولات القياسية. لتحليل البيانات، افتح الملفات في برنامج التحليل السيتوميتري المناسب للتدفق. تعيين بوابة مستطيلة تبدأ من أعلى المؤامرة تمتد من زاوية صغيرة ضوء مبعثر مستوى في مرة واحدة 10 إلى اثنين إلى واحد مرات 10 إلى الأربعة وبذلك البوابة إلى أسفل حتى أنه يحتوي على حوالي 2.5٪ من مجموع الأحداث.
اسم البوابة بعد التحقيق ونسخ ولصق البوابة على العينتين الأخرى والسيطرة على المؤامرات البيانات. ثم قم بتصدير التحليل إلى جدول بيانات. هنا، تظهر النتائج التمثيلية من 10 تكرارات بيولوجية.
التقلبات بين تكرارات ليس كبيرة والخطأ نموذجيّة معياريّة من الوسط من الالسّكان حجم قليلا على 10٪ ينتج نقل الحيوانات بين صفائح في حوالي 10٪ خسارة الحيوانات, بينما حوالي 20٪ من الحيوانات يكون خسرت في ال [سكروس] تعويم خطوة. في المتوسط، سيفرز 1000 من النوع البري من الشباب الصغار ميكروغرام واحد من البروتينات أكبر من 10 كيلودالتون في بيئتهم. عندما يتم فصل هذا الكسر كذلك بواسطة الكروماتوغرافيا استبعاد الحجم، فإن إجمالي ميل البروتين يوضح ذروة بروتين صغيرة بين ملليلترين إلى ستة وذرية كبيرة بعد ثمانية ملليلتر.
يتم احتواء العُيَضَل خارج الخلية داخل المليلترات الخمسة الأولى من رُحَل العمود. في مقارنة مباشرة من خصائص تدفق الخلايا بين C.elegans والضويصلات خارج الخلية البشرية، وهو مدرج بياني من C.elegans الأحداث عينة من الخلايا خارج الخلية، وفرزها من زاوية صغيرة مبعثر ضوء، ويبين أن جميع الاستعدادات الذروة في شدة الفلورانس المتوسط من حوالي مرة واحدة مرة إلى الثالثة. المسبار القوي DI-8-ANEPPS، تسميات بقوة C.elegans خارج الخلية vesicles ووفرة من الخلايا الخارجة عن الخلية المنقى فرزها من قبل التعبير DI-8-ANEPPS لا تختلف اختلافا كبيرا بين C.elegans وثقافة الخلية المستمدة من الاستعدادات.
العينات التي أعدتها هذه العملية قابلة لجميع أساليب تحليل الخلايا خارج الخلية المصبية النموذجية، بما في ذلك الحمض النووي الريبي-SEQ، وقياس الخلايا التدفقي، وتحليل تتبع الجسيمات النانوية، وتحليل البروتيوم. إن إنشاء طرق لتنقية الحويصلات خارج الخلية من C.elegans يسمح للباحثين باستخدام هذا النموذج اللافقاري البسيط لدراسة المسارات الوراثية والعمليات الفسيولوجية التي تؤثر على تكوين شحنة الحويصلات خارج الخلية.
