O campo de vesícula extracelular não possui modelo de invertebrado geneticamente tratável para estudar os sinais de proteína e RNA de vesículas extracelulares. Este protocolo estabelece os métodos para a obtenção de vesículas extracelulares abundantes e puras de C.elegans. Isso é suficiente para uma análise robusta de RNA-SEQ e proteômica.
Quando a cultura sincronizada C.elegans tiver esgotado o alimento de sua placa média de crescimento normal, use elásticos para fixar uma tampa de filtro de malha de nylon de cinco micrômetros em uma garrafa estéril e iniciar um vácuo. Despeje os worms L1 no filtro e passe um volume igual de meio sobre os agregados do worm. Após o vórtice, transfira três volumes de 10 microliter da suspensão do verme para uma tampa de placa de cultivo de vermes e conte o número de animais em cada gota.
Ajuste a suspensão do verme para dois animais por microliter de meio fresco e vórtice da suspensão novamente. Em seguida, adicione nove, 10 gotas de microliter de vermes em uma nova tampa de placa e conte manualmente o número de animais em cada gota. Em seguida, calcule o erro médio e padrão da média como uma porcentagem de cada população de vermes e calcule o número total de animais em cada população.
Para preparar os vermes para a geração secretame, lave os vermes com três lavagens de cinco minutos em 15 mililitros de meio M9 estéril com 50 microgramas por mililitro de carbenicilina por placa por lavagem com redemoinho suave para desalojar os vermes, agrupando as lavagens em um tubo cúrico de 50 mililitros. Após a última lavagem, dilui os vermes para um animal por microliter de solução S-Basileia suplementada com 2,5 microgramas por mililitro de colesterol e 50 concentrações de carbenicilina micromolar. Em seguida, adicione 400 mililitros da suspensão do verme a um frasco estéril de dois litros desoperado.
Coloque o frasco em um rotador circular a 20 graus Celsius e 100 rotações por minuto durante 24 horas. Para a colheita de vesículas extracelular, transfira os vermes em um tubo cônico de 50 mililitros para centrifugação e decante o sobrenadante através de um filtro de vácuo de 0,22 micrômetros para remover quaisquer detritos de partículas. Após a contagem, coloque uma gota de vermes suspensos em um gramado bacteriano e marque os animais como em movimento, paralisados ou mortos após 15 minutos.
Em seguida, concentre o supernatante filtrado em 700 microliters com um filtro de corte de peso molecular de 10 quilodalton e adicione 150 microlitadores de solução S-Basileia fresca à redução. Filtrar e vórtice a solução resultante e repetir a redução e filtragem mais duas vezes como apenas demonstrado. Após a última filtragem, centrífuga o supernascido para remover quaisquer partículas e detritos que possam ter se acumulado durante o manuseio e adicionar coquetel inibidor de protease mais EDTA de acordo com as instruções do fabricante.
Para preparar a coluna de exclusão de tamanho, decantar 15 mililitros de resina suspensa agarose em um cartucho vazio de coluna de fluxo de gravidade. Quando a coluna tiver drenado, adicione a solução S-Basileia até que a cama de resina esteja embalada em um volume final de 10 mililitros. Substitua o tampão de resina por 40 mililitros de solução S-Basileia filtrada estéril, tomando cuidado para não perturbar a resina e permitir que a gravidade escorra o buffer através da coluna.
Uma vez que a parte superior da resina não esteja mais submersa, cubra a parte inferior do cartucho para parar o fluxo e coloque um tubo de coleta sob a coluna. Para iniciar o fracionamento secretome, remova a tampa e adicione imediatamente a solução secretame concentrada em termos de gota ao topo da cama da coluna, seguida pela adição de um mililitro da solução S-Basill drop-wise. Coloque um tubo de coleta fresco sob a coluna e encha lentamente o reservatório da coluna superior com cinco mililitros de solução S-Basel.
Depois de coletar os dois primeiros mililitros de elunato, altere rapidamente os tubos para coletar os próximos quatro mililitros. Use um filtro de spin de corte de peso molecular de 10 kilodalton regenerado para concentrar a vesícula extracelular contendo elunato de coluna para 300 microliters e transferir o retentato do filtro para um tubo de microcentrifuuge de baixa ligação. Em seguida, lave a membrana do filtro duas vezes com 100 microlitadores de solução S-Basileia a 20 segundos de vórtice por lavagem e combine as lavagens com o retent original para um volume amostral final de 500 microliters.
Para preparar as vesículas extracelulares para quantificação por análise citométrica de fluxo, adicione 840 microliters de solução S-Basill e 60 microliters de vesículas extracelulares purificadas a um tubo de microcentrifuuge. Adicione 300 microliters da amostra em dois tubos adicionais de microcentrifuuuge, juntamente com sete microliters de uma sonda potencialiométrica apropriada por tubo. Adicione sete microliters de 1%Triton X-100 ao último tubo e misture todos os tubos por vórtice.
Coloque uma ponta de sonicator no centro do tubo da terceira amostra e pulso a amostra 10 vezes com 20% de potência e um ciclo de 30%. Em seguida, adicione 300 microliters de solução S-Basileia a dois tubos de microcentrifuuge de controle e adicione sete microliters de sonda ao tubo de corante apenas. Rotule apenas o segundo tubo tampão.
Em seguida, incubar todos os tubos por uma hora à temperatura ambiente protegidos da luz antes de sua análise por citometria de fluxo de acordo com os protocolos padrão. Para analisar os dados, abra os arquivos no software de análise citométrica de fluxo apropriado. Defina um portão retangular começando no topo da trama abrangendo do pequeno nível de dispersão de luz angular em uma vez 10 para o 2 a 10 vezes 10 para o quatro e trazendo o portão para baixo até que contenha cerca de 2,5% do total de eventos.
Nomeie o portão após a sonda e copie e cole o portão nas outras duas tabelas de dados e controle. Em seguida, exporte a análise para uma planilha. Aqui, resultados representativos de 10 réplicas biológicas são mostrados.
A variabilidade entre as réplicas não é significativa e o erro padrão típico da média do tamanho populacional é de pouco mais de 10% A transferência de animais entre as placas resulta em cerca de 10% de perda de animais, enquanto cerca de 20% dos animais são perdidos na etapa de flutuação de sacarose. Em média, 1.000 animais adultos jovens do tipo selvagem segregarão um micrograma de proteínas maiores que 10 kilodaltons em seu ambiente. Quando esta fração é ainda mais separada pela cromatografia de exclusão de tamanho, o perfil total de elução de proteínas demonstra um pequeno pico de proteína entre dois a seis mililitros e um grande pico após oito mililitros.
As vesículas extracelulares estão contidas nos primeiros cinco mililitros da coluna eluada. Em uma comparação direta das características da citometria de fluxo entre C.elegans e vesículas extracelulares humanas, um histograma de eventos de amostra de vesícula extracelular C.elegans, classificados por pequena dispersão de luz de ângulo, mostra que todos os preparativos atingem uma intensidade média de fluorescência de aproximadamente uma vez 10 a 10. A sonda potencialiométrica DI-8-ANEPPS, robustamente rotula vesículas extracelulares C.elegans e a abundância de vesículas extracelulares purificadas classificadas pela expressão DI-8-ANEPPS não é significativamente diferente entre c.elegans e preparações derivadas da cultura celular.
As amostras preparadas por este procedimento são favoráveis a todos os métodos típicos de análise de vesículas extracelulares a jusante, incluindo RNA-SEQ, citometria de fluxo, análise de rastreamento de nanopartículas e análise proteômica. Estabelecer métodos para purificar vesículas extracelulares C.elegans permite que os pesquisadores usem esse modelo de invertebrado simples para estudar as vias genéticas e processos fisiológicos que impactam a composição de carga vesículas extracelulares.
