Il campo vescicolare extracellulare è privo di un modello di invertebrato geneticamente trattabile per studiare i segnali proteici e di RNA delle vescicole extracellulari. Questo protocollo stabilisce i metodi per ottenere vescicole extracellulari abbondanti e pure da C.elegans. Questo è sufficiente per una robusta analisi RNA-SEQ e proteomica.
Quando la coltura sincronizzata C.elegans ha esaurito il cibo dalla loro normale piastra media di crescita, utilizzare elastici per fissare un tappo filtrante in rete di nylon da cinque micrometri su una bottiglia sterile e iniziare un vuoto. Versare i worm L1 sul filtro e passare un volume uguale di mezzo sugli aggregati del verme. Dopo il vortice, trasferire tre volumi di 10 microliter della sospensione del verme su un coperchio di una piastra di coltivazione del verme e contare il numero di animali in ogni goccia.
Regolare la sospensione del verme su due animali per microlitro di mezzo fresco e vortice di nuovo la sospensione. Quindi, aggiungi nove, 10 gocce di vermi microliter su un nuovo coperchio della piastra e conta manualmente il numero di animali in ogni goccia. Quindi calcola l'errore medio e standard della media come percentuale di ogni popolazione di vermi e calcola il numero totale di animali in ogni popolazione.
Per preparare i vermi per la generazione di secretome, lavare i vermi con tre lavaggi di cinque minuti in 15 millilitri di mezzo M9 sterile con 50 microgrammi per millilitro di carbenicillina per piatto per lavaggio con un delicato vorticoso per spodestiare i vermi, raggruppando i lavaggi in un tubo conico da 50 millilitri. Dopo l'ultimo lavaggio, diluire i vermi in un animale per microlitro di soluzione S-Basilea integrato con 2,5 microgrammi per millilitro di colesterolo e 50 concentrazione di carbenicillina micromolare. Quindi aggiungere fino a 400 millilitri della sospensione del verme a un pallone sterile sconcertato dal fondo da due litri.
Posizionare il pallone su un rotatore circolare a 20 gradi Celsius e 100 rotazioni al minuto per 24 ore. Per la raccolta di vescicole extracellulari, trasferire i vermi in un tubo conico da 50 millilitri per la centrifugazione e decantare il supernatante attraverso un filtro sottovuoto da 0,22 micrometri per rimuovere eventuali detriti di particolato. Dopo il conteggio, posiziona una goccia di vermi sospesi su un prato batterico e segna gli animali come in movimento, paralizzati o morti dopo 15 minuti.
Successivamente, concentrare il supernatante filtrato a 700 microlitri con un filtro di taglio del peso molecolare di nitrocellulosa rigenerata da 10 kilodalton e aggiungere alla riduzione 150 microlitri di soluzione fresca di S-Basilea. Filtrare e vortice la soluzione risultante e ripetere la riduzione e la filtrazione altre due volte come appena dimostrato. Dopo l'ultima filtrazione, centrifugare il supernatante per rimuovere eventuali particelle e detriti che potrebbero essersi accumulati durante la manipolazione e aggiungere cocktail inibitore della proteasi più EDTA secondo le istruzioni del produttore.
Per preparare la colonna di esclusione delle dimensioni, decantare 15 millilitri di resina di agarosio sospesa in una cartuccia a colonna di flusso di gravità vuota. Una volta scaricata la colonna, aggiungere la soluzione S-Basilea fino a quando il letto in resina non viene imballato ad un volume finale di 10 millilitri. Sostituire il tampone in resina con 40 millilitri di soluzione S-Basilea filtrata sterile, facendo attenzione a non disturbare la resina, e lasciare che la gravità scarichi il tampone attraverso la colonna.
Una volta che la parte superiore della resina non è più sommersa, tappare il fondo della cartuccia per interrompere il flusso e posizionare un tubo di raccolta sotto la colonna. Per avviare il frazionamento del secretome, rimuovere il cappuccio e aggiungere immediatamente la soluzione di secretome concentrata per quanto riguarda la caduta nella parte superiore del letto della colonna, seguita dall'aggiunta di un millilitro di soluzione S-Basilea per quanto riguarda la caduta. Posizionare un tubo di raccolta fresco sotto la colonna e riempire lentamente il serbatoio della colonna superiore con cinque millilitri di soluzione S-Basilea.
Dopo aver raccolto i primi due millilitri di eluito, cambiare rapidamente i tubi per raccogliere i successivi quattro millilitri. Utilizzare un filtro di spin di taglio a peso molecolare nitrocellulosa rigenerato da 10 kilodalton per concentrare la vescicola extracellulare contenente eluito di colonna a 300 microlitri e trasferire il filtro a un tubo di microcentrifugo a basso legame. Quindi lavare la membrana filtrante due volte con 100 microlitri di soluzione S-Basilea a 20 secondi di vortice per lavaggio e combinare i lavaggi con il retentato originale per un volume finale del campione di 500 microlitri.
Per preparare le vescicole extracellulari per la quantificazione mediante analisi citometrica del flusso, aggiungere 840 microlitri di soluzione S-Basilea e 60 microlitri di vescicole extracellulari purificate a un tubo di microcentrifugo. Aggiungere 300 microlitri del campione in due tubi di microcentrifugo aggiuntivi insieme a sette microlitri di un'appropriata sonda potenziometrica per tubo. Aggiungere sette microlitri dell'1%Triton X-100 all'ultimo tubo e mescolare tutti i tubi con il vortice.
Posizionare una punta del sonicatore al centro del tubo del terzo campione e pulsare il campione 10 volte al 20% di potenza e a un ciclo di servizio del 30%. Successivamente, aggiungere 300 microlitri di soluzione S-Basilea a due tubi di microcentrifugo di controllo e aggiungere sette microlitri di sonda all'unico tubo di tintura. Etichettare il secondo tubo Buffer Only.
Quindi incubare tutti i tubi per un'ora a temperatura ambiente protetti dalla luce prima della loro analisi mediante citometria a flusso secondo protocolli standard. Per analizzare i dati, aprire i file nel software di analisi citometrica del flusso appropriato. Impostare un cancello rettangolare partendo dalla parte superiore del tracciato che si estende dal livello di dispersione della luce ad angolo ridotto a uno per 10 a due a uno per 10 a quattro e portando il cancello verso il basso fino a quando non contiene circa il 2,5% degli eventi totali.
Denominare il cancello dopo la sonda e copiare e incollare il cancello sugli altri due campionamenti e controllare i grafici dati. Quindi esportare l'analisi in un foglio di calcolo. Qui vengono mostrati i risultati rappresentativi di 10 repliche biologiche.
La variabilità tra le repliche non è significativa e l'errore standard tipico della media della dimensione della popolazione è poco più del 10%Il trasferimento di animali tra le piastre comporta una perdita di circa il 10% degli animali, mentre circa il 20% degli animali viene perso nella fase di galleggiamento del saccarosio. In media, 1.000 giovani animali adulti di tipo selvatico secernono un microgrammo di proteine più grandi di 10 kilodalton nel loro ambiente. Quando questa frazione è ulteriormente separata dalla cromatografia di esclusione delle dimensioni, il profilo di eluizione totale delle proteine dimostra un piccolo picco proteico tra due e sei millilitri e un grande picco dopo otto millilitri.
Le vescicole extracellulari sono contenute all'interno dei primi cinque millilitri dell'eluito di colonna. In un confronto diretto delle caratteristiche della citometria del flusso tra C.elegans e vescicole extracellulari umane, un istogramma di eventi del campione di vescicola extracellulare C.elegans, ordinati per piccola dispersione di luce angolare, mostra che tutti i preparati picchiano ad un'intensità di fluorescenza media di circa uno per 10 al terzo. La sonda potenziometrica DI-8-ANEPPS, etichetta robustamente le vescicole extracellulari C.elegans e l'abbondanza di vescicole extracellulari purificate ordinate per l'espressione DI-8-ANEPPS non è significativamente diversa tra C.elegans e preparazioni derivate dalla coltura cellulare.
I campioni preparati con questa procedura sono disponibili per tutti i tipici metodi di analisi vescicolare extracellulare a valle, tra cui RNA-SEQ, citometria del flusso, analisi di tracciamento delle nanoparticelle e analisi proteomica. Stabilire metodi per purificare le vescicole extracellulari C.elegans consente ai ricercatori di utilizzare questo semplice modello di invertebrato per studiare le vie genetiche e i processi fisiologici che hanno un impatto sulla composizione del carico vescicolare extracellulare.
