توفر هذه الطريقة تحرير الجينات CRISPR-Cas9 بسرعة ودرجة الحرارة تحت جزيء صغير، Shield-1. كما أنه يوفر تأثيرات أقل خارج الهدف ، وانخفاض سمية الخلية ، وكذلك تحرير الجينات أعلى تسيطر عليها داخليا عند مقارنتها تنشيط التأسيسية للكاس9. الميزة الرئيسية لهذا الجسيم هو أنه يمكن استخدامه لتوصيف الجينات الأساسية، فضلا عن جينات البقاء على قيد الحياة الورم.
إن زعزعة استقرار DD-Cas9 مستقلة عن تعبيرها ، وهذا يسمح بالتعبير المشترك عن جين الاهتمام تحت نفس المروج. يمكن تطبيق هذه الطريقة بسهولة على في الجسم الحي وفي الدراسات المختبرية. درع-1 يمكن أن تخترق أيضا من خلال حاجز الدم في الدماغ، مما يجعل من السهل أيضا لدراسة الجينات التي تشارك في نمو الدماغ.
بالتساوي البذور خلايا صحية HEK293T في كثافة 1-2 مليون خلية لكل 10 سم لوحة زراعة الأنسجة باستخدام 10 ملليلتر من DMEM الجلوكوز مع 10٪ FBS المصفاة. احتضان الخلايا في حاضنة زراعة الأنسجة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية لمدة 20 ساعة. في اليوم التالي، تأكد من أن الخلايا وصلت إلى 70٪ التقاء عن طريق المجهر برايتفيلد وأنها موزعة بالتساوي عبر لوحة.
تغيير الوسائط قبل ساعة واحدة من التحويل مع وحدة تخزين نهائية من 10 ملليلتر. إعداد أنبوبين مع 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام الدافئة. أضف 25 ميكرولتر من كاشف العدوى إلى الأنبوب الأول، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
إلى الأنبوب الآخر، أضف خليطا من البلازميدات. مزيج أنبوب واحد مع أنبوب اثنين لتشكيل خليط transfection، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. إضافة خليط العدوى المنسدلة إلى خلايا HEK293T واحتضان لوحة في حاضنة ثقافة الأنسجة.
بعد 18 ساعة، قم بتغيير الوسائط بعناية إلى 10 ملليلترات من DMEM الطازجة مع 10٪ FBS لإزالة كاشف العدوى. احتضان الخلايا لل 48 ساعة القادمة. بعد 48 ساعة، اجمع الناطقة الفائقة بحقنة 10 ملليلتر ومررها عبر فلتر 0.45 ميكرومتر.
Aliquot الفيروس العملاق وتخزينه في ناقص 80 درجة مئوية. لتحديد تيتر الفيروس، البذور 5 ملايين خلايا HEK293T لكل بئر في اثنين من لوحات ستة آبار. احتضان كل من لوحات في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها للوصول إلى 50 إلى 60٪ التقاء.
في اليوم التالي، استخدم إحدى اللوحات ذات الآبار الستة لحساب الخلايا في الآبار الستة. تذوب aliquot الفيروس التي ستستخدم لأداء التخفيف التسلسلي وإضافة ثمانية ميكروغرام لكل ملليلتر من كاشف البوليبرين، وإعداد DMEM مع 10٪ FBS لتخفيف المسلسل من الفيروس، وإضافة كاشف البوليبرين. إعداد اثنين من ملليلتر من تخفيف المسلسل عشرة أضعاف من الفيروس العدسي من 0.1 إلى 0.0001 في البوليبرين التي تحتوي على وسائل الإعلام.
إزالة وسائل الإعلام من لوحة ستة آبار وإضافة ملليلتر واحد من التخفيفات الفيروسية إلى الآبار، وترك بئر واحد مع وسائل الإعلام وحدها كسيطرة سلبية وجيد واحد مع فيروس 100٪. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، قم بإزالة الوسائط المصابة بالفيروس من لوحات الآبار الستة وغيرها إلى ملليلترين من DMEM الطازجة بنسبة 10٪FBS.
احتضان الخلايا لمدة 48 إلى 72 ساعة، ومراقبة GFP مع المجهر الفلورسنت كل يوم. بعد 48 إلى 72 ساعة، فصل الخلايا وإعادة إنفاقها في الحد الأقصى العازلة. استخدم مقياس تدفق الخلايا لتحديد النسبة المئوية لتعبير GFP وحساب تاتر الفيروس باستخدام الصيغة المعطاة في مخطوطة النص.
لوحة خط الخلية من الفائدة في لوحة 10 سم واحتضان بين عشية وضحاها للوصول إلى التقاء 50 إلى 60٪ثم تصيب الخلايا مع 500 إلى 2، 000 ميكرولتر من جزيئات الفيروس في حجم إجمالي 10 ملليلتر من المتوسطة الثقافة. احتضان وسائل الإعلام الفيروسية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، قم بتغيير الوسائط الفيروسية إلى وسائط الثقافة، وحدد النسبة المئوية للخلايا الإيجابية ل GFP باستخدام قياس التدفق الخلوي.
حدد الخلايا الإيجابية GFP باستخدام BD FACSAria II لفرز الخلايا. توسيع الخلايا المختارة بشكل إيجابي وتجميد المخزون. صفيحة الخلايا المختارة بشكل إيجابي والخلايا غير المنقولة في لوحات 12 بئرا بشكل منفصل ، بعد 24 ساعة من العدوى.
انتظر حتى إرفاق الخلايا وتغيير الوسائط إلى وسائط ثقافة الخلية التي تحتوي على 200 nanomolar Shield-1. استبدال الوسائط في لوحات مع الخلايا المنقولة وغير المنقولة، وترك بئرين لكل لوحة مع وسائل الإعلام العادية كعنصر تحكم سلبي. احتضان واستخراج البروتينات من كل بئر في صفر، اثنين، ستة، 12، 24، 48، و 72 ساعة بعد إضافة الدرع-1 إلى الآبار.
ثم إزالة وسائل الإعلام مع درع-1 من بقية الآبار وتغييره لوسائل الإعلام الخلية العادية. جمع البروتينات من تلك الآبار في ساعتين وستة و 12 ساعة بعد تغيير وسائل الإعلام. تم تأكيد تحريض بروتين Cas9 من خلال مستويات التعبير التي تكون متشابهة بين الخلايا المنقولة والسيارة ، على الرغم من وجود أو غياب Shield-1.
هناك ما يكفي من التعريفي التعبير Cas9 في خط الخلية A549 المنقولة بعد ساعتين من العلاج مع الدرع-1، والتي تصبح ضئيلة في غضون ست إلى 12 ساعة بعد انسحاب الدرع-1. الدرع-1 تعامل الخلايا A549 المنقولة انخفض في العدد بعد 48 ساعة دون التأثير على عينة رينيلا, التي تم التحقق من صحتها عن طريق immunoblotting باستخدام الأجسام المضادة ضد البروتين RPA3 المنضب. تم تأكيد انعكاس تحرير الجينات أو طفرات indel باستخدام مقايسات نواة المساح.
كان بناء ناقلات الفيروس العدسي المصمم نظاما للسيتسيترونيك يحمل جينا آخر مهما تحت نفس المروج EF-1a. وأضيف بروتين فلوري معدل، P2A، لتتبع الخلايا المصابة. لوحظ التعبير عن بروتين mVenus في السيارة والخلايا المحولة A549 ، بغض النظر عن تعبير DD-Cas9 وعلاج Shield-1.
إن النقل الفعال لخط الخلية مع ناقل DD-Cas9 هو أحد الخطوات المقيدة للمعدل ، لوجود خلايا HEK293T صحية واستخدام عدد المرور المنخفض أمر بالغ الأهمية. التحسين من النسبة بين DD-Cas9 plasmid، التعبئة والتغليف البلازميد، وplasmid المغلف مهم جدا لtransfection الأمثل. ولكن بجانبه ، أيضا كمية الدرع -1 اللازمة لتحقيق الاستقرار في الخلايا المستهدفة DD-Cas9 هو شيء تحتاج إلى توخي الحذر منه.
وDD-Cas9 مع كريم البلازميد هو متاح أيضا، ويمكن استخدامه لدراسة التفاعلات الجينية في دراسات في الجسم الحي على أساس نظام كري لوكسي.
