Bu yöntem, Shield-1 adlı küçük bir molekül altında hızlı, sıcaklık kontrollü CRISPR-Cas9 gen düzenleme sağlar. Ayrıca Cas9'un konsitülatif aktivasyonu ile karşılaştırırken daha az hedef dışı etki, daha düşük hücre toksisitesi ve ayrıca daha yüksek dahili kontrollü gen düzenleme sunar. Bu parçacığın ana avantajı, tümör sağkalım genlerinin yanı sıra temel genlerin karakterizasyonu için kullanılabilmesidir.
DD-Cas9'un istikrarsızlaştırılması ifadesinden bağımsızdır ve bu, ilgi geninin aynı organizatör altında birlikte ifade edilmesine izin verir. Bu yöntem in vivo ve in vitro çalışmalara kolayca uygulanabilir. Shield-1 ayrıca kan-beyin bariyerine de nüfuz edebilir, bu da beyin gelişiminde rol oynayan genleri incelemeyi kolaylaştırır.
%10 filtreli FBS ile 10 mililitre glikoz DMEM kullanarak 10 santimetre doku kültürü plakası başına bir ila iki milyon hücre yoğunluğunda sağlıklı HEK293T hücrelerini eşit olarak tohumlar. Doku kültürü inkübatöründeki hücreleri 20 saat boyunca %5 karbondioksit ve 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, hücrelerin brightfield mikroskopisi ile% 70 izdiah ulaştığından ve plaka boyunca eşit olarak dağıldığını onaylayın.
Transeksiyondan bir saat önce medyayı 10 mililitrelik son hacimle değiştirin. 500 mikrolitre sıcak ortam ile iki tüp hazırlayın. Tüp bire 25 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın.
Diğer tüpe plazmid karışımı ekleyin. Bir transfeksiyon karışımı oluşturmak için tüp bir ile tüp iki karıştırın ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Transfeksiyon karışımını HEK293T hücrelerine damla yönünde ekleyin ve plakayı doku kültürü inkübatörüne inkübatöre ekleyin.
18 saat sonra, transfeksiyon reaktifini çıkarmak için ortamı %10 FBS ile 10 mililitre taze DMEM'e dikkatlice değiştirin. Önümüzdeki 48 saat boyunca hücreleri kuluçkaya yatır. 48 saat sonra, süpernatant 10 mililitre şırınga ile toplayın ve 0.45 mikrometre filtreden geçirin.
Aliquot virüs süpernatant ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Virüs titresini belirlemek için, iki altı kuyu plakasına kuyu başına 5 milyon HEK293T hücresi tohumlayın. Her iki plakayı da 37 santigrat derecede ve bir gecede% 5 karbondioksit ile kuluçkaya yatırarak% 50 ila% 60 izdiah eder.
Ertesi gün, altı kuyudaki hücreleri saymak için altı kuyu plakalarından birini kullanın. Seri seyreltmeyi gerçekleştirmek ve mililitre polibren reaktifi başına sekiz mikrogram eklemek için kullanılacak virüs aliquotunu çözün, virüsün seri seyreltilmesi için% 10 FBS ile DMEM hazırlayın ve polibren reaktifini ekleyin. Polibren içeren ortamda lentivirüs 0.1 ila 0.0001 arasında iki mililitre on kat seri seyreltme hazırlayın.
Medyayı altı kuyu plakasından çıkarın ve kuyulara bir mililitre viral seyreltme ekleyin, bir kuyuyu medya ile tek başına negatif kontrol ve bir kuyuyu% 100 virüs ile bırakın. Hücreleri 24 saat kuluçkaya yatır. Ertesi gün, virüsle birlikte medyayı altı kuyu plakalarından çıkarın ve% 10 FBS ile iki mililitre taze DMEM'e değiştirin.
Hücreleri 48 ila 72 saat kuluçkaya yatırarak GFP'yi her gün floresan mikroskopla gözlemler. 48 ila 72 saat sonra, hücreleri ayırın ve maksimum arabellekte yeniden biriktirin. GFP ifadesinin yüzdesini belirlemek ve metin el yazmasında verilen formülü kullanarak virüs titresini hesaplamak için bir akış sitometresi kullanın.
10 santimetrelik bir plakaya ilgi hücre hattını plakala ve %50 ila %60'lık bir izdiah süresine ulaşmak için gece boyunca kuluçkaya yatırın, ardından hücrelere 10 mililitrelik toplam kültür ortamında 500 ila 2.000 mikrolitre virüs parçacığı bulaştırın. Viral medyayı 24 saat kuluçkaya yatır. Ertesi gün, viral ortamı kültür ortamı olarak değiştirin ve akış sitometrisi kullanarak GFP pozitif hücrelerinin yüzdesini belirleyin.
Hücre sıralama için BD FACSAria II kullanarak GFP pozitif hücrelerini seçin. Pozitif olarak seçilen hücreleri genişletin ve stoğu dondurun. Pozitif olarak seçilen hücreleri ve çevrilmemiş hücreleri enfeksiyondan 24 saat sonra, 12 kuyulu plakalarda ayrı ayrı plakalayın.
Hücreler takılana kadar bekleyin ve ortamı 200 nanomolar Shield-1 içeren hücre kültürü ortamına değiştirin. Plakalardaki ortamı transdüklenmiş ve çevrilmemiş hücrelerle değiştirin ve plaka başına iki kuyuyu negatif kontrol olarak normal ortamla bırakın. Kuyulara Shield-1 ekledikten sonra her kuyudan sıfır, iki, altı, 12, 24, 48 ve 72 saat içinde proteinleri inkübte edin ve çıkarın.
Ardından Shield-1 ile medyayı kuyuların geri kalanından çıkarın ve normal hücre ortamı için değiştirin. Medyayı değiştirdikten 2, 6 ve 12 saat sonra bu kuyulardan proteinleri toplayın. Cas9 proteininin indüksiyonu, Shield-1'in varlığına veya yokluğuna rağmen, transdüklenmiş hücreler ve araç arasında benzer ifade seviyeleri ile doğrulandı.
Shield-1 ile tedaviden iki saat sonra transdüklenmiş A549 hücre hattında Cas9 ekspresyonunun yeterli indüksiyonu vardır, bu da Shield-1'in çekilmesinden sonraki altı ila 12 saat içinde ihmal edilebilir hale gelir. Shield-1 tedavi edilen transdüklenmiş A549 hücreleri, tükenen RPA3 proteinine karşı bir antikor kullanılarak immünblotting ile doğrulanan Rinella örneğini etkilemeden 48 saat sonra sayı olarak azaldı. Gen düzenleme inversiyonu veya indel mutasyonları eksper nükleaz tahlilleri kullanılarak doğrulandı.
Tasarlanan lentivirüs vektör yapısı, aynı EF-1a promotörü altında başka bir ilgi geni taşıyan bir bicistronic sistemiydi. Enfekte hücrelerin izini sürmek için modifiye edilmiş bir floresan protein olan P2A eklendi. Araçta ve A549 transdüklenmiş hücrelerde DD-Cas9 ekspresykülü ve Shield-1 tedavisinden bağımsız olarak mVenus proteininin ekspresykülü gözlendi.
DD-Cas9 vektörü ile hücre hattının verimli bir şekilde transdüksiyonu, sağlıklı HEK293T hücrelerine sahip olmak ve düşük geçiş sayılarını kullanmak için hız sınırlayıcı adımlardan biridir. DD-Cas9 plazmid, ambalaj plazmidi ve zarf plazmidi arasındaki oranın optimizasyonu optimal transfeksiyon için çok önemlidir. Ama bunun yanında, DD-Cas9 hedef hücrelerini stabilize etmek için gereken Shield-1 miktarı da dikkatli olmanız gereken bir şeydir.
Cre plazmidli DD-Cas9 da mevcuttur ve Cre-lox sistemine dayanan in vivo çalışmalarda genetik etkileşimleri incelemek için kullanılabilir.
