توفر شاشات التسرب التي تم فحصها من CRISPR للباحثين طريقة بسيطة وفعالة وغير مكلفة لاستجواب وظيفة السلسلة على مستوى الجينوم. وميزة CRISPR هو قابلية لتحرير أي جين ببساطة عن طريق تغيير تسلسل الدليل. تمكن المكتبات الإرشادية CRISPR الباحثين من استجواب الجينوم الكامل لأي كائن حي في تجربة واحدة بطريقة منهجية غير متحيزة.
وفي الوقت الحالي، تُستخدم شاشات كريسبر لتحديد الجينات الأساسية عبر مئات أنواع السرطان البشرية ولخريطة التفاعلات الجينية. يمكن للشاشات أيضًا تقديم صورة شاملة للأدوية للكشف عن آليات عمل المخدرات. تستهدف مكتبات CRISPR الموصوفة هنا الخلايا البشرية.
ومع ذلك، فإن المكتبات الإرشادية التي تستهدف الأنواع الأخرى، مثل الفأرة، متاحة ويمكن فحصها بشكل مماثل. يمكن أن يكون أداء الشاشات على نطاق الجينوم في الخلايا البشرية شاقًا في الممارسة العملية ، لأنه ينطوي على التعامل مع عشرات الملايين من الخلايا ويتطلب تحليل مجموعات كبيرة من البيانات. قبل بدء تشغيل الشاشة، تأكد من أن خطوط الخلايا تتميز بعناية.
وهذا يشمل معرفة نقاء خط الخلية الخاص بك، ومضاعفة الوقت، وكفاءة تحويل فيروس العدس، والحساسيات إلى عوامل اختيار المضادات الحيوية. سوف مظاهرة بصرية تقديم صورة لكيفية التعامل عمليا الملايين من الخلايا المطلوبة في الشاشة وتتبع الآلاف من الانزعاج بطريقة منهجية. سيكون إثبات الإجراء هو أندريا حبسيد، كمالديب أولخ، وريان كليمي، وجميعهم فنيون من مختبري.
ابدأ بتحويل مجموعة CRISPR sgRNA plasmid الجاهزة إلى خلايا ذات اكشن كهربائي وتناميها وفقًا لتوجيهات المخطوطات. عندما تكون على استعداد لحصاد المستعمرات، إضافة سبعة ملليلتر من LB مع كاربينيسيلين إلى كل لوحة وكشط المستعمرات قبالة مع موزع الخلية. استخدام ماصة 10 ملليلتر لنقل الخلايا كشط في قارورة مخروطية معقمة لتر واحد، وشطف لوحة مع خمسة ملليلتر من LB مع كاربينيسيلين.
مرة أخرى، نقل محلول الشطف إلى القارورة. الطرد المركزي الخلايا وفقا لاتجاهات المخطوطات، ومن ثم، تحديد وزن بيليه الرطب. تنقية الحمض النووي البلازميد باستخدام ماكسي أو ميجا مقياس بلازميد مجموعة تنقية.
إعداد الخلايا لtransfection عن طريق بذر 293 الخلايا التائية واحتضانها بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، إعداد خليط البلازمي الترانليف الثلاثة للوحات 15 سم. حساب كمية من plasmid اللازمة لtransfection واحد وجعل مزيج من plasmids لعدد من لوحات، زائد واحد، أن تكون مصابة.
المقبل, إعداد كاشف transfection القائم على الدهون لكل transfection و aliquot-انخفاض وسائل الإعلام المصل في أنابيب 1.5 ملليلتر microcentuge الفردية لعدد من لوحات إلى أن تكون مصابة. يُضاف كاشف النتروبات، ويُخلط بلطف، ويحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة، إضافة الحمض النووي إلى كاشف transfection في نسبة ثلاثة إلى واحد من كاشف نقل إلى ميكروغرام من مجمع الحمض النووي.
اخلطي الحل بلطف واتركيه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. إضافة خليط transfection إلى خلايا التعبئة والتغليف واحتضانها وفقا لاتجاهات المخطوطات. في يوم الحصاد الفيروسي ، تحقق من الخلايا للتأكد من التشكل غير الطبيعي والمصهر كمؤشر على إنتاج فيروس جيد ، وحصاد فيروس العدس عن طريق جمع المابير ونقله إلى أنبوب طرد مركزي معقمة.
ابدأ بتحديد تغطية مكتبة RNA دليل CRISPR ليتم الاحتفاظ بها في جميع أنحاء الشاشة. بناء على تغطية المكتبة، تحديد عدد الخلايا المطلوبة للحفاظ على كل RNA دليل وعدد الخلايا اللازمة للعدوى في وزارة الداخلية 0.3. بعد ذلك، تحديد عدد الأطباق المطلوبة لإعداد العدوى ومن ثم، حصاد وبذات الخلايا إلى كل لوحة.
يضاف بروميد الهيكسادي ميثرين إلى جميع الألواح ويضاف الحجم المطلوب من الفيروس إلى فحص والسيطرة على اثنين من الصفائح. لا تقم بإضافة الفيروس للتحكم في واحد. استبدل وحدة التخزين هذه بوسائط.
اخلطي الأطباق جيداً عن طريق إمالة اللوحات ووضعها في حاضنة، مع التأكد من أنها مستوية. حصاد الخلايا المصابة وفقا لتوجيهات المخطوطات وجمع ثلاثة نسخ متماثلة من كريات الخلية من الخلايا المجمعة لاستخراج الحمض النووي الجينومي. الطرد المركزي الخلايا في 500 مرة ز لمدة خمس دقائق وغسلها مع برنامج تلفزيوني.
تسمية الأنابيب وتجميد جف الكريات الخلية في ناقص 80 درجة مئوية. تقسيم تجمع الخلايا المصابة إلى ثلاث مجموعات النسخ المتماثل، مع التأكد من الحفاظ على تغطية المكتبة داخل كل نسخة متماثلة. بذور الخلايا في كثافة التي من شأنها أن تستخدم عادة عند توسيعها.
استخدم نفس عدد الخلايا لكل نسخة متماثلة ونفس العدد الإجمالي للخلايا بين النسخ المتماثل. الاستمرار في مرور الخلايا والحصاد ثلاثة يكرر من الكريات الخلية من كل تكرار من الخلايا المصابة تجمع لمدة تصل إلى 15 إلى 20 مضاعفة الخلايا. في كل ممر، حصاد الخلايا من جميع لوحات في كل تكرار مع بعضها البعض.
تسمية كل بيليه مع الوقت وتكرار التسمية. قم بإعداد PCR1 وفقًا لتوجيهات المخطوطات بإجمالي 100 ميكروغرام من الحمض النووي الجينومي بمعدل 3.5 ميكروغرام من الحمض النووي الجينومي لكل تفاعل 50 ميكرولتر وقم بإعداد تفاعلات متطابقة من 50 ميكرولتر لتحقيق التغطية المطلوبة. إعداد تفاعل أنبوب PCR واحد وفقًا لاتجاهات المخطوطة.
استخدم خمسة ميكرولترات من المنتج PCR1 المجمعة كقالب واستخدم مجموعات التمهيدي الفهرس فريدة لكل عينة فردية للسماح بتجميع عينات مكتبة التسلسل. بعد الانتهاء من PCR، تشغيل المنتج أنبوب PCR على جل agarose 2٪ في الجهد المنخفض لمدة ساعة إلى 1 1/2 ساعة. تصور المنتج على الترانسيومينات الضوء الأزرق و مزيل الفرقة 200 زوج قاعدة.
تنقية الحمض النووي وقياس كميته وجودته مع كل من مطياف ومقياس الفلور. وينبغي أن يكون دليل مكتبة RNA دليل مثالي كل دليل واحد RNA يمثل في كميات مماثلة. ويمكن استخدام تسلسل الجيل التالي لتأكيد أن المكتبة لديها توزيع ضيق من RNAs دليل.
يمكن استخدام تحليل الدقة في التذكر لتقييم أداء الشاشة. وينبغي أن الشاشة عالية الأداء استرداد عدد كبير من الجينات الأساسية في عامل أساسي أكبر من ستة ومعدل اكتشاف كاذبة أقل من 5٪ منحنى الدقة استدعاء ينبغي أن يكون الكوع حادة وخط مستقيم إلى نقطة المحطة الطرفية. عامل Bayes يمثل مقياس الثقة أن الجينات خروج المغلوب يؤدي إلى عيب في اللياقة البدنية.
تشير الدرجات العالية إلى زيادة الثقة، في حين تشير الدرجات المنخفضة إلى أن الضربة القاضية للجين توفر مزايا النمو. يمكن استزراع برك خروج المغلوب على نطاق الجينوم في وجود عامل المخدرات الزائدة للبحث عن جينات مقاومة القامع. لتنفيذ شاشة اختيار إيجابية لـ suppressor كتلة thymidine، يتم رسمها عدد قراءة تطبيع لكافة RNAs الدليل في T0 ضد يعني-تطبيع عدد قراءة العينات المعالجة thymidine.
ومن التفاصيل الرئيسية لأداء شاشات CRISPR بنجاح هو الحفاظ على التوزيع الجيد لكل RNA دليل، بدءا من transfection من البلازميد إلى نقل الخلايا. وهذا سوف يقلل من فرصة الآثار العشوائية التي يمكن أن ينحرف دليل تمثيل RNA ويؤدي إلى نتائج إيجابية أو سلبية كاذبة. بعد التحقق من صحة الشاشة، يجب إجراء التجارب لتأكيد مرات الدخول لأن الشاشة الأساسية تحدد فقط الزيارات المحتملة.
اعتمادا على البيولوجيا من يضرب، يمكن استخدام أساليب مختلفة. وقد مكّن تحرير CRISPR، إلى جانب تسلسل الجيل التالي، من فقدان شاشات الوظائف على نطاق الجينوم في أنظمة النماذج البشرية المتنوعة. نظرًا لبساطة CRISPR ، أصبحت هذه الأنواع من الشاشات متاحة الآن على نطاق واسع لجميع الباحثين ، مما يسمح لمزيد من العلماء باستخدام الطرق الوراثية الوظيفية لدراسة العمليات البيولوجية والأمراض.
