이 방법은 작은 분자, Shield-1하에서 빠른 온도 조절 CRISPR-Cas9 유전자 편집을 제공합니다. 또한 Cas9의 구성 활성화와 비교할 때 더 적은 오프 타겟 효과, 낮은 세포 독성, 또한 더 높은 내부적으로 통제 된 유전자 편집을 제공합니다. 이 입자의 주요 장점은 종양 생존 유전자뿐만 아니라 필수 유전자의 특성화에 사용될 수 있다는 것입니다.
DD-Cas9의 불안정화는 발현과 무관하며, 이를 통해 관심 유전자가 동일한 프로모터하에서 공동 발현될 수 있습니다. 이 방법은 생체 내 및 시험관 내 연구에 쉽게 적용할 수 있습니다. 쉴드-1은 또한 혈액 두뇌 장벽을 통해 침투할 수 있습니다, 이는 또한 두뇌 발달에 관련시키는 유전자를 공부하기 쉽게 만드는.
10% 여과된 FBS를 가진 포도당 DMEM의 10 밀리리터를 사용하여 10센티미터 조직 배양 판당 1~2백만 개의 세포밀도로 건강한 HEK293T 세포를 균등하게 종자하였다. 조직 배양 인큐베이터에서 세포를 20시간 동안 이산화탄소 5% 및 섭씨 37도로 배양합니다. 다음 날, 세포가 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 70 %의 합류에 도달하고 그(것)들이 접시를 통해 고르게 분산된다는 것을 확인합니다.
10 밀리리터의 최종 볼륨으로 트랜스퍼션 1시간 전에 미디어를 변경합니다. 따뜻한 매체의 500 마이크로 리터와 두 개의 튜브를 준비합니다. 25 마이크로리터의 트랜스페트 시약을 튜브 1에 추가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
다른 튜브에 플라스미드를 혼합하여 넣습니다. 튜브 2와 튜브를 혼합하여 형질 혼합물을 형성하고 실온에서 20 분 동안 배양하십시오. HEK293T 세포에 속하면 배설 혼합물을 추가하고 조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를 배양한다.
18시간 후, 10%의 FBS로 미디어를 10밀리리터의 신선한 DMEM으로 조심스럽게 변경하여 트랜스페트 시약을 제거합니다. 다음 48 시간 동안 세포를 배양합니다. 48시간 후, 10밀리리터 주사기로 상수체를 수집하고 0.45 마이크로미터 필터를 통과합니다.
Aliquot 바이러스 상체를 인용 하 고 영하 80 섭씨에 저장. 바이러스 티터를 결정하기 위해, 씨앗 5 백만 HEK293T 세포 는 두 개의 6 웰 플레이트로 잘 당. 두 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 하룻밤 사이에 배양하여 50~60%의 인플루엔자에 도달합니다.
다음 날, 6 웰 플레이트 중 하나를 사용하여 6 개의 우물에서 세포를 계산하십시오. 직렬 희석을 수행하고 폴리브레인 시약의 밀리리터 당 8 마이크로 그램을 추가하는 데 사용되는 바이러스 알리코트해, 바이러스의 직렬 희석을 위해 10 %의 FBS로 DMEM을 준비하고 폴리 브레인 시약을 추가합니다. 미디어를 포함하는 폴리브레네에서 렌티 바이러스의 10배 연속 희석제 2밀리리터를 0.1에서 0.0001로 준비합니다.
6웰 플레이트에서 미디어를 제거하고 우물에 바이러스 희석1 밀리리터를 추가하여 부정적인 제어로 미디어를 잘 만들고 100 % 바이러스가 잘 결합됩니다. 세포를 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 6 웰 플레이트에서 바이러스로 미디어를 제거하고 10 %의 FBS와 신선한 DMEM의 두 밀리리터로 변경합니다.
세포를 48~72시간 동안 배양하여 매일 형광 현미경으로 GFP를 관찰합니다. 48~72시간 후에는 세포를 분리하고 최대 버퍼로 다시 일시 중지합니다. 흐름 사이토미터를 사용하여 GFP 식의 백분율을 결정하고 텍스트 원고에 제공된 수식을 사용하여 바이러스 티터를 계산합니다.
10센티미터 플레이트에 관심 있는 세포줄을 플레이트하고 하룻밤 동안 배양하여 50~60%의 합류에 도달한 다음, 10밀리리터의 배양 배지에서 바이러스 입자의 500~2, 000 마이크로리터로 세포를 감염시킵니다. 바이러스 성 미디어를 24 시간 동안 배양하십시오. 다음 날, 바이러스 성 매체를 배양 매체로 변경하고 유동 세포 측정을 사용하여 GFP 양성 세포의 비율을 결정합니다.
세포 정렬을 위해 BD FACSAria II를 사용하여 GFP 양성 셀을 선택합니다. 긍정적으로 선택된 셀을 확장하고 재고를 동결합니다. 12웰 플레이트에서 양적으로 선택된 세포와 추론되지 않은 세포를 감염 후 24시간 별도로 플레이트한다.
세포가 200 나노 몰러 쉴드-1을 포함하는 세포 배양 매체로 미디어를 연결하고 변경할 때까지 기다립니다. 플레이트의 미디어를 변환및 변환되지 않은 셀로 교체하여 플레이트당 두 개의 우물을 음수 제어로 일반 미디어로 남깁니다. 우물에 Shield-1을 추가한 후 0, 2, 6, 12, 24, 48 및 72시간 동안 각 우물에서 단백질을 배양하고 추출합니다.
그런 다음 나머지 우물에서 Shield-1로 미디어를 제거하고 일반 세포 매체를 변경합니다. 미디어를 변경한 후 2시간, 6시간, 12시간 후에 해당 우물에서 단백질을 수집합니다. Cas9 단백질의 유도는 Shield-1의 존재 또는 부재에도 불구하고 유도된 세포 및 차량 사이에서 유사한 발현 수준에 의해 확인되었다.
쉴드-1을 통해 치료 후 2시간 후에 트랜스유도된 A549 세포주에서 Cas9 발현의 충분한 유도가 있으며, 이는 Shield-1의 철수 후 6~12시간 이내에 무시할 수 있게 된다. Shield-1 은 고갈된 RPA3 단백질에 대한 항체를 사용하여 면역 블로팅을 사용하여 검증된 리넬라 샘플에 영향을 미치지 않고 48시간 후에 A549 세포를 배설하였다. 유전자 편집 반전 또는 인델 돌연변이는 측량체 핵세아제 어세약를 사용하여 확인되었다.
설계된 렌즈바이러스 벡터 구조는 동일한 EF-1a 프로모터하에서 다른 관심 유전자를 베어링하는 이두근 시스템이었습니다. 변형된 형광 단백질인 P2A가 감염된 세포를 추적하기 위해 첨가되었습니다. mVenus 단백질의 발현은 DD-Cas9 발현 및 쉴드-1 처리와 무관한 차량 및 A549 트랜스듀싱 된 세포에서 관찰되었다.
DD-Cas9 벡터를 갖는 세포주의 효율적인 트랜스포메이션은 건강한 HEK293T 세포를 갖는 데, 낮은 통로 수를 사용하기 위한 속도 제한 단계 중 하나입니다. DD-Cas9 플라스미드, 패키징 플라스미드 및 봉투 플라스미드 사이의 비율의 최적화는 최적의 트랜스펙트에 매우 중요합니다. 그러나 그 옆에, 또한 DD-Cas9 표적 세포를 안정화하는 데 필요한 쉴드-1의 양은 조심해야 할 것입니다.
Cre-plasmid와 DD-Cas9도 사용할 수 있습니다., 그리고 그것은 Cre-lox 시스템에 따라 생체 내 연구에서 유전 상호 작용을 연구 하는 데 사용할 수 있습니다.
