Este método fornece edição rápida e controlada por temperatura do gene CRISPR-Cas9 sob uma pequena molécula, Shield-1. Ele também oferece menos efeitos fora do alvo, menor toxicidade celular, e também maior edição de genes controlados internamente ao compará-lo com a ativação constitutiva do Cas9. A principal vantagem dessa partícula é que ela pode ser usada para caracterização de genes essenciais, bem como genes de sobrevivência tumoral.
A desestabilização do DD-Cas9 é independente de sua expressão, e isso permite que o gene de interesse seja co-expresso sob o mesmo promotor. Este método pode ser facilmente aplicado a estudos in vivo e in vitro. O Escudo-1 também pode penetrar através da barreira hemencefálica, o que torna mais fácil também estudar genes que estão envolvidos no desenvolvimento cerebral.
Células HEK293T saudáveis de sementes uniformemente a uma densidade de um a dois milhões de células por placa de cultura tecidual de 10 centímetros usando 10 mililitros de DMEM de glicose com FBS 10% filtrados. Incubar as células da incubadora de cultura tecidual a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius por 20 horas. No dia seguinte, confirme que as células atingiram 70% de confluência por microscopia de campo brilhante e que estão uniformemente dispersas pela placa.
Mude a mídia uma hora antes da transfecção com um volume final de 10 mililitros. Prepare dois tubos com 500 microliters de mídia quente. Adicione 25 microliters de reagente de transfecção ao tubo um e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos.
Ao outro tubo, adicione uma mistura de plasmídeos. Misture o tubo um com o tubo dois para formar uma mistura de transfecção e incubar à temperatura ambiente por 20 minutos. Adicione a mistura de transfecção dropwise às células HEK293T e incubar a placa na incubadora de cultura tecidual.
Após 18 horas, mude cuidadosamente a mídia para 10 mililitros de DMEM fresco com 10% de FBS para remover o reagente de transfecção. Incubar as células pelas próximas 48 horas. Após 48 horas, colete o supernascer com uma seringa de 10 mililitros e passe-a através de um filtro de 0,45 micrômetros.
Aliquot o vírus supernante e armazene-o a menos 80 graus Celsius. Para determinar o titulação do vírus, sementes 5 milhões de células HEK293T por poço em duas placas de seis poços. Incubar ambas as placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante a noite para atingir 50 a 60% de confluência.
No dia seguinte, use uma das placas de seis poços para contar as células nos seis poços. Descongele a alíquota do vírus que será usada para realizar a diluição serial e adicione oito microgramas por mililitro de reagente de polibreno, prepare o DMEM com 10% de FBS para diluição serial do vírus e adicione o reagente de polibreno. Prepare dois mililitros de diluições seriais dez vezes do lentivírus de 0,1 a 0,0001 em polibrene contendo mídia.
Remova a mídia da placa de seis poços e adicione um mililitro de diluições virais aos poços, deixando um bem com a mídia sozinho como um controle negativo e um poço com 100% de vírus. Incubar as células por 24 horas. No dia seguinte, remova a mídia com o vírus das placas de seis poços e mude-a para dois mililitros de DMEM frescos com 10% de FBS.
Incubar as células por 48 a 72 horas, observando gfp com um microscópio fluorescente todos os dias. Após 48 a 72 horas, desprende as células e resuspensá-las no tampão máximo. Use um citômetro de fluxo para determinar a porcentagem de expressão GFP e calcular o titulador do vírus usando a fórmula dada no manuscrito do texto.
Plaque a linha celular de interesse em uma placa de 10 centímetros e incuba durante a noite para alcançar a confluência de 50 a 60% Em seguida, infecte as células com 500 a 2.000 microliters de partículas de vírus em um volume total de 10 mililitros de meio de cultura. Incubar a mídia viral por 24 horas. No dia seguinte, mude a mídia viral para a mídia cultural e determine a porcentagem de células positivas de GFP usando citometria de fluxo.
Selecione células positivas GFP usando BD FACSAria II para classificação celular. Expanda células selecionadas positivamente e congele o estoque. Aplaque as células positivamente selecionadas e células não traduzidas em placas de 12 poços separadamente, 24 horas após a infecção.
Aguarde até que as células se conectem e alterem a mídia para a mídia de cultura celular contendo 200 escudos nanomolar-1. Substitua a mídia nas placas por células transduzidas e não traduzidas, deixando dois poços por placa com mídia regular como um controle negativo. Incubar e extrair proteínas de cada poço a zero, dois, seis, 12, 24, 48 e 72 horas depois de adicionar Shield-1 aos poços.
Em seguida, remova a mídia com shield-1 do resto dos poços e mude-a para mídia celular regular. Colete as proteínas desses poços em dois, seis e 12 horas depois de mudar a mídia. A indução da proteína Cas9 foi confirmada por seus níveis de expressão serem semelhantes entre as células transduzidas e o veículo, apesar da presença ou ausência de Shield-1.
Há indução suficiente da expressão Cas9 na linha celular A549 transduzida duas horas após o tratamento com Shield-1, que se torna insignificante dentro de seis a 12 horas após a retirada do Shield-1. As células A549 tratadas do Escudo-1 diminuíram em número após 48 horas sem afetar a amostra de Rinella, que foi validada por imunoblotação usando um anticorpo contra a proteína RPA3 empobrecida. A inversão de edição de genes ou mutações indel foram confirmadas usando ensaios nuclease do agrimensor.
A construção vetorial de lentivírus projetada foi um sistema bicistronic com outro gene de interesse sob o mesmo promotor EF-1a. Uma proteína fluorescente modificada, P2A, foi adicionada para rastrear células infectadas. A expressão da proteína mVenus foi observada no veículo e células transduzidas A549, independente da expressão DD-Cas9 e do tratamento Shield-1.
A transdução eficiente da linha celular com vetor DD-Cas9 é uma das etapas limitantes da taxa, por ter células HEK293T saudáveis e usar seu número de passagem baixa é crucial. A otimização da razão entre plasmídeo DD-Cas9, plasmídeo de embalagem e plasmídeo envelope é muito importante para a transfecção ideal. Mas ao lado dele, também a quantidade de Shield-1 que é necessária para estabilizar células-alvo DD-Cas9 é algo que você precisa ter cuidado.
O DD-Cas9 com o plasmídeo Cre também está disponível, e pode ser usado para estudar as interações genéticas em estudos in vivo baseados no sistema Cre-lox.
