ويود المؤلفان أن يشكرا سيلين جانتي على مساعدتها في إنشاء الكريات الخلوية مع علاج MG-132 على النحو المبين في النتائج التمثيلية وإليز مومارتس على توفيرها لكريات الإشريكية القولونية المستخدمة في البروتوكول.

1. إعداد معيار الببتيد الثقيلة
<ol><li>اعتمادا على المورد وجودة الببتيدات الثقيلة التي تم شراؤها ، فإن الببتيدات الثقيلة تحتاج إلى تخفيفها. استخدم هذا البروتوكول تسلسل الببتيد المبلغ عنها في الجدول 1، مع الأحماض الأمينية C-terminal المعدلة إلى ليسين(13C615N2-lysine) أو أرجينين (13C615N4- أرجينين).<ol>
<li>خلط الببتيدات الثقيلة، وتمييع المزيج مع 50٪ أسيتونيتريل (ACN) لإنشاء مزيج الببتيد مع كل الببتيد في 10 ميكرومتر.</li>
		<li>إنشاء aliquots من مزيج الببتيد وتخزينها في -80 درجة مئوية.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. إعداد العينة
<ol><li>تحلل العينة ملاحظة: يجب مراعاة استقرار سلاسل ubiquitin أثناء إعداد العينة. الحفاظ على العينات البيولوجية والمخازن المؤقتة المبردة في 4 درجة مئوية وإضافة عينات إلى التخزين المؤقت استقرار ubiquitin في أسرع وقت ممكن.<ol>
<li>إعداد حل من 1 M NH4HCO3 (بيكربونات الأمونيوم) في الماء وضبط درجة الحموضة إلى 8 باستخدام 1 M NaOH.</li>
		<li>إعداد حل من 200 mM N-ethylmaleimide (NEM) في الماء.</li>
		<li>إعداد ubiquitin استقرار العازلة باستخدام 8 M اليوريا في 50 mM NH4HCO3/10 mM NEM. يجب أن تكون مستعدة يوبيكيتين استقرار العازلة طازجة في كل مرة. ملاحظة: سوف يتطلب محلول 5 مل من 8 M يوريا أقل بكثير من 5 مل من الماء نظرا لتوسيع المياه عندما تكون في محلول مشبع مع اليوريا. تنبيه: لا تعد العازل فوق 50 درجة مئوية بسبب ميل اليوريا إلى تشكيل البولي يوريا في درجات حرارة عالية.</li>
		<li>Resuspend العينة البيولوجية التي سيتم التحقيق فيها في العازلة استقرار في كل مكان تهدف إلى 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر من البروتين وlyse الخلايا مع طريقة مناسبة للعينة. طريقة سونيكيشن تتكون من ثلاث نبضات 10 ق مع سونيفير برانسون SFX 150 تعيين في كثافة 70٪ مع فواصل 10 ق على الجليد بين كل نبضة، واستخدمت لخطوط الخلية في هذا البروتوكول.</li>
		<li>عينة الطرد المركزي في 18,000 x g لمدة 10 دقائق عند 4 °C في جهاز طرد مركزي على سطح الطاولة.</li>
		<li>نقل supernatant إلى أنبوب الطارد الدقيق ملزمة منخفضة البروتين الطازجة. يمكن تخزين العينات عند -20 درجة مئوية عند هذه النقطة إذا لزم الأمر.</li>
	</ol></li>
	<li>إعداد العينة والضوابط
	<ol>
<li>إذا تم تجميد العينات، اخلط (على سبيل المثال، مع ثيرموميكسر) أثناء إذابتها لإذابة اليوريا بسرعة. تنبيه: لا تستخدم درجات حرارة أعلى من 50 درجة مئوية بسبب ميل اليوريا لتشكيل البولي يوريا في درجات حرارة عالية.</li>
		<li>عينة الطرد المركزي في 18,000 x g لمدة 10 دقائق عند 4 °C في جهاز طرد مركزي على سطح الطاولة.</li>
		<li>نقل 20 ميكروغرام من العينة إلى أنبوب طرد دقيق منخفض الربط جديد وضبط مستوى الصوت إلى 50 ميكرولتر مع حاجز تثبيت كل مكان.</li>
		<li>إنشاء عنصر تحكم سالب باستخدام وحدة تخزين طبيعية من المخزن المؤقت لتثبيت ubiquitin (50 ميكرولتر). في هذه العينة ، لا ينبغي أن تكون هناك نسخة خفيفة من كل ببتيد ، مما يسمح بمراقبة أي تلوث خفيف ينشأ عن الببتيدات الثقيلة. واستخدمت هذه السيطرة السلبية أيضا لجدولة وقت الاحتفاظ ب PRM الموضحة في القسم 3-1.</li>
		<li>كما تم إنشاء سيطرة إيجابية مع التخزين المؤقت لتثبيت ubiquitin وإضافة أنواع السلسلة المتاحة تجاريا إلى الحجم الطبيعي لحاجز تثبيت ubiquitin (50 ميكرولتر). عادة، K63، K48، و M1 متوفرة. في النتائج التمثيلية 20 نانوغرام من K48، K63، و M1 استخدمت.</li>
	</ol></li>
	<li>الحد، الألكيل، والهضم
	<ol>
<li>إعداد حل من بيكربونات الأمونيوم 50 mm (NH4HCO3) في الماء وضبط العينة إلى درجة الحموضة = 8 مع 1 M NaOH.</li>
		<li>تم طرد ثقافة الإشريكية القولونية التي تزرع في مرق LB 5000 × ز لمدة 5 دقائق لتشكيل بيليه ، والتي تم غسلها بعد ذلك 2x مع PBS قبل إعادة الإنفاق في حاجز تثبيت في كل مكان عند 5 ميكروغرام / ميكرولتر.</li>
		<li>أضف 1 ميكروغرام من lysate الإشريكية القولونية إلى كل عينة والتحكم. يستخدم هذا البروتوكول الإشريكية القولونية (DH10B)، ولكن يمكن استخدام أي lysate معقدة دون كل مكان. لاحظ أن كل مكان مشترك بين جميع eukaryotes. ملاحظة: استخدام مصفوفة lysate القولونية يقلل من فقدان الببتيدات بسبب التصاق غير محدد إلى الأواني البلاستيكية. هذا ملحوظ بشكل خاص في السيطرة السلبية أو عينات مع محتوى البروتين محدودة ولها تأثير قوي على مراقبة K6312.</li>
		<li>إعداد حل من 500 مللي متر تريس (2-carboxyethyl)فوسفين (TCEP) في MS الصف المياه (DTT يمكن استخدامها كبديل).</li>
		<li>تقليل العينات والضوابط بإضافة TCEP إلى تركيز نهائي قدره 50 mM. دوامة لفترة وجيزة قبل احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). إذا تم استخدام DTT، يجب رفع درجة الحرارة إلى 50 درجة مئوية. تنبيه: لا تستخدم درجات حرارة أعلى من 50 درجة مئوية بسبب ميل اليوريا لتشكيل البولي يوريا في درجات حرارة عالية.</li>
		<li>إعداد حل من 550 mM الكلورواسيتاميد (CAA) في NH4HCO3. تخزين في الظلام.</li>
		<li>Alkylate العينات والضوابط بإضافة CAA إلى تركيز النهائي من 55 mM. دوامة لفترة وجيزة قبل احتضان لمدة 20 دقيقة في RT في الظلام. ملاحظة: يستخدم CAA بدلا من iodoacetamide كعامل تخفيض لتقليل فرصة تعديل كارباميدوميثيل مزدوج (114.0429) على بقايا ليسين يجري مخطئا لتعديل -GG (114.0429)13.</li>
		<li>إضافة endopeptidase LysC إلى العينات في 1:25 (ث / ث) نسبة إلى محتوى البروتين. حضانة لمدة 3 ساعة في 37 درجة مئوية.</li>
		<li>تمييع العينات والضوابط مع 200 ميكرولتر من 50 م م NH4HCO3 درجة الحموضة = 8 (1:5 v/v).</li>
		<li>إضافة تريبسين إلى العينات في 1:25 ث / ث نسبة إلى محتوى البروتين. حضانة لمدة 12 ساعة في 37 درجة مئوية.</li>
		<li>إضافة 10٪ محلول حمض الفورميك (FA) في مياه درجة MS بنسبة 1:10 v/v إلى كل عينة وعينة تحكم. تحقق من أن درجة الحموضة هي < 3) قبل تنظيف C18 وإضافة المزيد من حمض الفورميك إذا لزم الأمر.</li>
		<li>لكل عينة والتحكم إضافة 0.5 ميكرولتر من معيار الببتيد الثقيلة التي تم إنشاؤها في القسم 1.</li>
	</ol></li>
	<li>تنظيف الببتيد
	<ol>
<li>تقدم العديد من الشركات المصنعة نصائح تنظيف C18 أو لوحات. اتبع تعليمات الشركة المصنعة للمنتج المستخدم، والببتيدات المجففة في جهاز طرد مركزي فراغ، وعلى استعداد لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد.</li>
	</ol></li>
</ol>3. تحليل LC-MS/MS
<ol><li>تنفيذ تحليل PRM الأولي على معيار الببتيد الثقيل بطريقة غير مقررة.<ol>
<li>Resuspend العينات المجففة في 10 ميكرولتر من MS تحميل العازلة 2٪ ACN/0.05٪ حمض ثلاثي فلوريستيك (TFA).</li>
		<li>تجهيز HPLC مع عكس المرحلة C18 عمود تحليلي (75 ميكرومتر × 15 سم، 2 ميكرومتر 100 Å C18 حبات) مصممة لnanoflow MS. شكل التدرجات الخطية تبادل المياه درجة MS تكملها مع 0.1٪ FA مع ACN تحتوي على 0.1٪ FA. تم استخدام عمود فخ التضحية (75 ميكرومتر × 2 سم ، 3 ميكرومتر ، 100 حبة18 Å C) للحفاظ على حياة العمود التحليلي هنا ولكن ليس مطلوبا.</li>
		<li>يزوج إخراج العمود التحليلي بمصدر نانو-ESI على مطياف كتلة عالي الدقة.</li>
		<li>استخدام طريقة بروتيوميات مستهدفة مناسبة لمطياف الكتلة. على سبيل المثال، على Q-Exactive بالإضافة إلى أسلوب التجربة اثنين، دورة بين MS الكامل وتجربة PRM. بالنسبة لتجربة التصلب المتعدد الكامل، تم استخدام حل قدره 120,000 مع هدف AGC من 1e6 و 240 مللي ثانية كحد أقصى. وبالنسبة لتجربة إدارة الحد من الفقر، استخدم نفس الهدف من نظام تحديد القيمة المضافة والحد الأقصى من تكنولوجيا المعلومات بدقة أقل قدرها 000 60 ونافذة عزل تبلغ 1.2 م/ض.</li>
		<li>حقن 200 نانوغرام من عنصر التحكم السلبي على العمود التحليلي باستخدام الطوابع التلقائية HPLC. تطبيق تدرج خطي على العينة على العمود التحليلي زيادة تركيز ACN من 2-25٪ على مدى فترة ~ 45 دقيقة. ملاحظة: تركيز ACN 25٪ أقل من المعتاد لبروتيوميات بسبب الطبيعة الهيدروفيلية المنخفضة للببتيدات النموذجية ذات الخصائص الطوبولوجية في كل مكان. وإذا كان للببتيدات الأخرى أن تحدد كميا، فقد يكون من المرغوب فيه تركيز أعلى لل ACN لتحقيق فصل جيد للهدف.</li>
		<li>تحليل نتائج تشغيل الجدولة كما هو موضح في المقطع 4.2 لإنشاء قائمة تضمين مجدولة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تحليل العينات<ol>
<li>تشغيل العينات المتبقية كما هو موضح للجدولة في 3.1 بصرف النظر عن استخدام قائمة التضمين المجدولة التي تم إنشاؤها في القسم 4.2. ملاحظة: يجب تشغيل فارغة بعد عنصر التحكم الإيجابي للتأكد من أنه يتم الكشف عن أي ترحيل من التشغيل السابق في عينات لاحقة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. تحليل البرمجيات
<ol><li>إنشاء قائمة تضمين التنسيق المناسب ل MS المستخدمة. استخدم هذا البروتوكول برنامج المصدر المفتوح Skyline (الإصدار 19.1.0.193) (https://skyline.ms)، والذي يقدم دعما ومساعدة موثقين جيدا. ويمكن إنشاء قائمة إدراج لعدة مطيافات كتلة باستخدام مرفق قائمة عزل الصادرات.<ol>
<li>افتح مستند Skyline جديد.</li>
		<li>حدد تعديلات النظائر الثقيلة حسب الاقتضاء للببتيدات الثقيلة المميزة للطبولوجيا. في الإعدادات| إعدادات الببتيد تحت علامة التبويب تعديل، انقر على حقل الاسم لرؤية التعديل المحتمل. ويستند الاختيار على الحالة النظيرية للببتيدات الثقيلة التي تم شراؤها. في هذا المثال، استخدمت الببتيدات الاصطناعية التي تحمل إما ليسين الثقيلة(13C615N2-lysine) أو أرجينين الثقيلة(13C615N4-arginine) في C-terminus. التسميات المناسبة ستكون: "Label:13C(6)15N(2) (C-term K)" و "Label:13C(6)15N(4) (C-term R)".</li>
		<li>حدد الإعدادات| الانتقال. ضمن علامة التبويب تصفية تشمل رسوم السلائف 2، 3، 4.</li>
		<li>إدراج الببتيدات عن طريق تحديد تحرير| إدراج| الببتيدات.</li>
		<li>قم بتعبئة الحقول ذات الصلة بما في ذلك تسلسل الببتيد المميز للطبولوجيا واسم البروتين (على سبيل المثال، "Chain-K63").</li>
		<li>توسيع كل الببتيد هو مبين الآن في لوحة الأهداف. حذف حالات الرسوم غير المرغوب فيها. حالة الشحنة المفضلة وطاقة التصادم ، والتي قد تختلف استنادا إلى مطياف الكتلة المستخدم ، لكل ببتيد مميز طوبولوجيا موضح في الجدول 1.</li>
		<li>لكل ببتيد طوبولوجيا مميزة (باستثناء M1 حيث يتم تضمين GG في التسلسل) انقر بزر الماوس الأيمن على التسلسل وحدد تعديل. إضافة GG كتعديلات هيكلية بالنقر فوق حقل الاسم وتحديد <إظهار كافة... > قبل اختيار "غليغلي (K)".</li>
		<li>تصدير ملف قائمة العزل| تصدير| قائمة العزل، حدد نوع الأداة وتعيين نوع الأسلوب إلى قياسي. سيؤدي تحديد موافق إلى فتح مطالبة لحفظ ملف .csv * يمكن استخدامه لإنشاء أسلوب PRM.</li>
	</ol></li>
	<li>إنشاء قائمة إدراج مجدولة استنادا إلى تشغيل جدولة الببتيد الثقيلة وأوضح هنا باستخدام برنامج أفق المصدر المفتوح.<ol>
<li>إنشاء قائمة أهداف كما هو موضح في المقطع 4.1.</li>
		<li>استيراد الجدولة تشغيل في 3.1 عن طريق تحديد ملف| استيراد| النتائج.</li>
		<li>راجع الهويات. يمكن ملاحظة الإشارة الثقيلة لكل ببتيد من خلال النقر على الكتلة لكل إدخال الببتيد الثقيل. غالبا ما يتم تحديد التعرف الصحيح على الذروة تلقائيا ، ولكن قد يتطلب البرنامج المعالجة اليدوية عن طريق تحديد الذروة باستخدام النقر والسحب تحت المحور س.</li>
		<li>يتم أيضا تطبيق أوقات الاستبقاء المحددة للمتغيرات الثقيلة على الإصدارات الخفيفة ، وبالتالي إنشاء جدول زمني ل PRM. يمكن تعديل إطار الجدولة ضمن الإعدادات| إعدادات الببتيد باستخدام علامة التبويب التنبؤ، عن طريق تغيير الإطار الزمني.</li>
		<li>يمكن الآن تصدير قائمة إدراج مجدولة باستخدام File| تصدير| قائمة العزل وتحديد نوع الأداة المناسبة ونوع أسلوب الإعداد إلى جدولة.</li>
	</ol></li>
	<li>تحليل البيانات.<ol>
<li>استيراد العينات بنفس الطريقة لتحليل تشغيل الجدولة في القسم 4.2.</li>
		<li>بعد الاستيراد الكامل لجميع العينات ، يوصى بعلاج التحولات. هذه هي العملية التي تتم من خلالها إزالة التحولات مع التداخل أو نسب الإشارة إلى الضوضاء الضعيفة. يظهر مثال على اللوني قبل وبعد المعالجة في الشكل 4.</li>
		<li>يمكن الآن تصدير البيانات إما عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على الرسوم البيانية ذات الصلة وتحديد نسخ البيانات أو عن طريق تحديد File| تصدير| النتائج.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+post-translational+modification+statistics:+frequency+analysis+and+curation+of+the+swiss-prot+database.">Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database.</a> Scientific Reports. 1, 90 (2011).</li><li>Goldstein, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+polypeptide+that+has+lymphocyte-differentiating+properties+and+is+probably+represented+universally+in+living+cells.">Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (1), 11-15 (1975).</li><li>Glickman, M. H., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway:+Destruction+for+the+sake+of+construction.">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: Destruction for the sake of construction.</a> Physiol. Rev. 82, 373-428 (2002).</li><li>Pickart, C. M., Eddins, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin:+structures,+functions,+mechanisms.">Ubiquitin: structures, functions, mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1695 (1-3), 55-72 (2004).</li><li>Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+diversity+at+a+glance.">Ubiquitin chain diversity at a glance.</a> Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).</li><li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+Code.">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li><li>Mattern, M., Sutherland, J., Kadimisetty, K., Barrio, R., Rodriguez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Ubiquitin+Binders+to+Decipher+the+Ubiquitin+Code.">Using Ubiquitin Binders to Decipher the Ubiquitin Code.</a> Trends in Biochemical Sciences. 44 (7), 599-615 (2019).</li><li>Newton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+editing+revealed+by+polyubiquitin+linkage-specific+antibodies.">Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies.</a> Cell. 134 (4), 668-678 (2008).</li><li>Spence, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle-regulated+modification+of+the+ribosome+by+a+variant+multiubiquitin+chain.">Cell cycle-regulated modification of the ribosome by a variant multiubiquitin chain.</a> Cell. 102 (1), 67-76 (2000).</li><li>Borr&#224;s, E., Sabid&#243;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+targeted+proteomics?+A+concise+revision+of+targeted+acquisition+and+targeted+data+analysis+in+mass+spectrometry.">What is targeted proteomics? A concise revision of targeted acquisition and targeted data analysis in mass spectrometry.</a> PROTEOMICS. 17 (17-18), (2017).</li><li>Lesur, A., Domon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+high-resolution+accurate+mass+spectrometry+application+to+targeted+proteomics.">Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics.</a> PROTEOMICS. 15 (5-6), 880-890 (2015).</li><li>Longworth, J., Dittmar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Ubiquitin+Chain+Topology+by+Targeted+Mass+Spectrometry.">Assessment of Ubiquitin Chain Topology by Targeted Mass Spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1977, 25-34 (2019).</li><li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry.">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li><li>Tawa, N. E., Odessey, R., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+proteasome+reduce+the+accelerated+proteolysis+in+atrophying+rat+skeletal+muscles.">Inhibitors of the proteasome reduce the accelerated proteolysis in atrophying rat skeletal muscles.</a> The Journal of Clinical Investigation. 100 (1), 197-203 (1997).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Collision+Energy+Optimization+on+the+Measurement+of+Peptides+by+Selected+Reaction+Monitoring+(SRM)+Mass+Spectrometry.">Effect of Collision Energy Optimization on the Measurement of Peptides by Selected Reaction Monitoring (SRM) Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82 (24), 10116-10124 (2010).</li></ol>

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح متنافسة.

تحليل حالة كل مكان داخل البروتيوم هو ذات أهمية متزايدة لمجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية. يجب أن يركز وصف حالة الانتشار في كل مكان للعينة ليس فقط على ملف البروتينات التي يتم نشرها في كل مكان ولكن أيضا على طوبولوجيا مثل هذا الانتشار. تقييم هذه الطوبولوجيا من قبل MS المستهدفة، كما هو موضح ه?...

التنظيم الوثيق لوظيفة البروتين والاستقرار له أهمية قصوى ، لأنها محركات رئيسية للسيطرة على علم الأحياء. يتم بناء وظيفة البروتين من عنصرين: تسلسله البوليبتيد الجوهري وأي تعديلات ما بعد النقل (PTMs). وقد تم تحديد مختلف PTMs الكيميائية بما في ذلك الجليكوزيليشن، الفوسفور، أسيتيل، والمثيلة1. في عام 1975، حدد غولدشتاين وآخرون2 بروتين صغير وأطلق عليه اسم يوبيكيتين بسبب طبيعته في كل مكان. تم العثور على يوبيكيتين أن تكون مهمة في تدهور البروتين3. ومع ذلك ، منذ ذلك الحين ثبت أن وظيفة كل مكان كجزيء إشارات تمتد إلى ما هو أبعد من تنظيم استقرار البروتين. وتشارك إشارة يوبيكيتين في مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية الأخرى, مثل استقرار البروتين, autophagy, خلية التحكم في دورة, والاتجار البروتين4.
في حين أن PTMs الأخرى ثنائية بشكل عام (أي يتم تعديل البروتين أو تركه غير معدل) لموقع معين ، يمكن أن يعدل ubiquitin بروتينا سواء كمونومر أو كسلسلة بوليمرية ، مع وجود كل مكان مرفق في حد ذاته في كل مكان. علاوة على ذلك ، يمكن أن تتطور سلسلة تعدد الأضلاع هذه في العديد من طبولوجيا مع انتشار كل مكان في كل مكان سابق يرتبط بأحد مواقع الربط الثمانية5،6. يتم نقل يوبيكيتين بواسطة عملية انزيمية متعددة الخطوات (الشكل 1) حيث يرتبط C-terminus من كل مكان إلى واحدة من بقايا اليسين السبعة (K06، K11، K27، K29، K33، K48، أو K63) أو N-محطة من ubiquitin السابقة (يشار إليها باسم M1 أو كل مكان خطي)5،6. هذه الطوبولوجيا السلسلة هو المفتاح لمصير البروتين قيد التعديل. على سبيل المثال ، فإن التعديل مع سلسلة K48 أو K11 المرتبطة يؤدي إلى تدهور البروتين المعدل في proteasome ، في حين أن سلسلة خطية ضرورية لتنشيط إشارات NF-kB. وبالتالي، فإن التوزيع النسبي لهذه السلاسل من طبولوجيا ذات صلة بمجموعة واسعة من المسائل البيولوجية.
استخدام قياس الطيف الكتلي (MS) هو ذات فائدة خاصة لتحليل طوبولوجيا سلسلة ubiquitin كما أنها لا تعتمد على التفاعلات القائمة على الأجسام المضادة أو تقارب القائم7،8، وكثير منها محدودة خصوصية ولا تفرق بين أنواع السلسلة المختلفة. وهناك احتمال مختلف للكشف هو استخدام المسوخ المعدلة وراثيا في كل مكان. هنا, يتم استبدال ليسين محددة للأرجينيين, التي لا يمكن أن تدعم التعديل عن طريق كل مكان. ثم يتم تفسير عدم وجود تشكيل سلسلة في كل مكان على بروتين الركيزة كدليل على طوبولوجيا محددة9.
ويستند تحديد MS القائم على البروتينات في كل مكان على حقيقة أن C-terminus من كل مكان يحتوي على بقايا أرجينين في الموقف 74 التي يتم التعرف عليها من قبل تريبسين أثناء إعداد بروتيوليك من العينات لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد, فصل الجليسين المزدوج C-المحطة الطرفية. هذا غليغلي (-GG) لا تزال تعلق على مجموعة الأمينية ε من بقايا اليسين من بروتين الركيزة. لتحليل طوبولوجيا في كل مكان، يحدث التعديل على واحدة من بقايا اليوزين السبعة في كل مكان. وهذا يخلق مجموعة من سبعة الببتيدات الرئيسية التي تحمل بقايا ليسين التي يتم تعديلها من قبل GG، محددة لكل من طبولوجيا(الشكل 2). على سبيل المثال، مع طوبولوجيا K06، سيتم حماية ال ليسين في الموقف 6 على تسلسل الأحماض الأمينية من الهضم المحاولة مع تعديل -GG من 114 دا إضافة إلى هذا اليوزين.
ويشار إلى تحديد الببتيدات محددة سلفا من قبل MS كما proteomics المستهدفة، أو على وجه التحديد، اقتناء الببتيدالمستهدفة 10. وقد تم تطوير طريقتين اعتمادا على أداء مطياف الكتلة المستخدمة. هذه هي رصد رد الفعل المختار (SRM) ، وتسمى أيضا رصد ردود الفعل المتعددة (MRM) ، ورصد التفاعل الموازي (PRM). SRM ينطوي على اختيار التحولات التي تتكون من السلائف م / ض والمنتج أيون م / ض. وعلى العكس من ذلك، لا يتطلب إجراء إعادة المتر سوى السلائف m/z. بعد التحديد، يتم إجراء مسح كامل لعملية مسح أيونات المنتج. هذا له ميزة أنه لا يوجد اختيار أيونات المنتج المناسب للكمية على مطياف الكتلة محددة ضروري قبل القياس11. ويمكن جدولة كل من إدارة الموارد البشرية واستراتيجية الحد من الفقر، اعتمادا على الصك. الجدولة هي ممارسة تعيين نافذة زمنية يتم خلالها تضمين أيون معين للتحليل ، حيث أن الببتيدات يتم تهييثها في أوقات احتجاز محددة من النظام الكروماتوغرافي. ويؤدي تخفيض عدد الأيونات التي يجري استجوابها في أي وقت من الأوقات إلى زيادة وتيرة استجواب تلك الأيونات المقرر إجراؤها في ذلك الوقت، مما يحسن دقة البيانات.
بشكل عام ، فإن تطبيق البروتيوميات المستهدفة لطبولوجيا كل مكان هو نفس أي تجربة بروتيوميات مستهدفة أخرى. ومع ذلك، هناك اختلافان رئيسيان مهمان: أولا، يجب النظر في استقرار سلاسل البيكيتين. هناك العديد من الإنزيمات القوية التي تتحلل بسرعة عند تحلل الخلايا. وproteases في كل مكان محددة تندرج في فئتين، وthioesterases و metalloproteases. معظم الهيدرولاسيس في كل مكان هي ثيويستراس وتحمل بقايا السيستين في مركزها النشط. عن طريق الألكيلات هذه بقايا السيستين، يمكن تعطيلها. على هذا النحو ، فإن استخدام مخازن تثبيت في كل مكان تحتوي على عوامل الألكيلات ، مثل N-ethylmaleimide (NEM) ، والمواد الكيميائية عالية الإزالة ، والحفاظ على العينات المبردة أمر حيوي لتحليل ناجح. ثانيا، على عكس التجارب المستهدفة الأخرى، يتم إصلاح خيار الببتيد. في تجربة نموذجية مستهدفة ، يمكن اختيار الببتيد البروتيوتيبيك لأداء كروماتوغرافي وتأين جيد. بالنسبة لبعض الببتيدات المميزة للطبولوجيا مثل K48 ، فإن هذه الخصائص جيدة ، بينما بالنسبة للآخرين ، فهي أقل جاذبية. على سبيل المثال ، K33 الكروماتوغرافيا في الإعداد نموذجية عكس المرحلة سيئة بسبب تشكيل ملف elution امتدت ، وضعف خصائص التأين من الببتيد K27 تقليل وضوحه من قبل MS12.
في هذا البروتوكول، ونحن نصف كيفية إجراء تقييم طوبولوجيا في كل مكان من عينة بيولوجية من قبل PRM. يتم تقديم بيانات مثال على الإجراء باستخدام اضطراب البروتيازوم باستخدام علاج مثبط MG-132 في عدة أنواع مختلفة من الخلايا.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrile (ACN)</td><td>Merck</td><td>100029</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate (ABC)</td><td>Fluka</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 16</td><td></td></tr><tr><td>Chloroacetamide (CAA)</td><td>Sigma</td><td>22790</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid (FA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85178</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Peptides</td><td>JPT Peptide Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Dionex</td><td>Ulitimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>LC Column</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>160321</td><td></td></tr><tr><td>Lys C</td><td>Wako</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>Mass Spectrometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q-Exactive Plus</td><td></td></tr><tr><td>N-ethylmaleimide (NEM)</td><td>ACROS Organics</td><td>156100050</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Chain K48</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-240</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Chain K63</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-340-100</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Chain M1</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-710B-025</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier</td><td>Branson sonifier</td><td>SFX 150</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer Comfort</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td><td>Sigam</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>77720</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>V1511A</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>Waters &amp;mu;Elution C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt; plates</td><td>Waters</td><td>186002318</td><td></td></tr></tbody></table>

ubiquitin chain analysis by parallel reaction monitoring

تقييم الصورة العالمية للنوبولوجيا سلسلة في كل مكان داخل البروتيوم هو من المهم الإجابة على مجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية. البروتوكول المبين هنا يستفيد من تعديل دي غليسين (-GG) المتبقي بعد الهضم المحاولة من يوبيكيتين أدرجت في سلسلة. من خلال تحديد كميا هذه الببتيدات ذات الخصائص الطوبولوجية يمكن تحديد الوفرة النسبية لكل طوبولوجيا سلسلة في كل مكان. وتفيد التقارير بأن الخطوات اللازمة لقياس هذه الببتيدات من خلال تجربة موازية لرصد التفاعل تأخذ في الاعتبار استقرار سلاسل كل مكان. يتم وصف إعداد الضوابط الثقيلة ، وتحلل الخلية ، والهضم جنبا إلى جنب مع إعداد مطياف الكتلة المناسبة وسير عمل تحليل البيانات. يتم تقديم مثال على مجموعة البيانات مع الاضطرابات في طوبولوجيا كل مكان ، مصحوبة بأمثلة عن كيفية تحسين البروتوكول يمكن أن تؤثر على النتائج. باتباع الخطوات المبينة ، سيتمكن المستخدم من إجراء تقييم عالمي لمناظر طوبولوجيا كل مكان في سياقه البيولوجي.

لإثبات استخدام تحليل سلسلة في كل مكان من قبل PRM ، تم اختيار ثلاثة خطوط الخلية: خط الخلية الميلانوما الماوس B16 ، وخطي الخلايا البشرية المشتركة A549 (الخلايا الظهارية السنية الغدية) وهيلا (خلايا سرطان عنق الرحم). نمت هذه الثقافات إلى مرحلة متوسطة في الوسائط المناسبة قبل أن يتم علاجها مع 0 أو 10 أو 1...

Watch this Scientific Journal Video about Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring at JoVE.com

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

تصف هذه الطريقة تقييم التغيرات العالمية في طوبولوجيا سلسلة ubiquitin. ويتم التقييم بتطبيق نهج البروتيوميات المستهدفة القائمة على قياس الطيف الكتلي.

تحليل سلسلة يوبيكيتين من خلال رصد التفاعل الموازي

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

ubiquitin-chain-analysis-by-parallel-reaction-monitoring

Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.5K Views.  Luxembourg Institute of Health. تصف هذه الطريقة تقييم التغيرات العالمية في طوبولوجيا سلسلة ubiquitin. ويتم التقييم بتطبيق نهج البروتيوميات المستهدفة القائمة على قياس الطيف الكتلي.

Video: Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which may be essential for a given protein&#39;s role both physiologically and pathologically. Enrichment of PTMs is often necessary when investigating the PTM status of a target protein, because PTMs are often transient and relatively low in abundance. Many pitfalls are encountered when enriching for a PTM of a target protein, such as buffer incompatibility, the target protein antibody is not IP-compatible, loss of PTM signal, and others. The degree of difficulty is magnified when investigating multiple PTMs like acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, and tyrosine phosphorylation for a given target protein. Studying a combination of these PTMs may be necessary, as crosstalk between PTMs is prevalent and critical for protein regulation. Often, these PTMs are studied in different lysis buffers and with unique inhibitor compositions. To simplify the process, a unique denaturing lysis system was developed that effectively isolates and preserves these four PTMs; thus, enabling investigation of potential crosstalk in a single lysis system. A unique filter system was engineered to remove contaminating genomic DNA from the lysate, which is a problematic by-product of denaturing buffers. Robust affinity matrices targeting each of the four PTMs were developed in concert with the buffer system to maximize the enrichment and detection of the endogenous states of these four PTMs. This comprehensive PTM detection toolset streamlines the process of obtaining critical information about whether a protein is modified by one or more of these PTMs.

Investigating multiple, endogenous post-translational modifications for a target protein can be extremely challenging. Techniques described here utilize an optimized lysis buffer and filter system developed with specific PTM-targeting, affinity matrices to detect the acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, and tyrosine phosphorylation modifications for a target protein using a single, streamlined system.

استخدام نظام إثراء إيمونوبريسيبيتيشن شاملة لتحديد ملف تعريف تعديل بوستترانسلاشونال ذاتية للبروتينات المستهدفة

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

الكشف عن مواقع اكتشاف البروتين من قبل إثراء الببتيد وقياس الطيف الكتلي

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

تنميط اوبيكويتين و اوبيكويتين-مثل التعديلات اللاحقة الانتقالية وتحديد التعديلات الهامه

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

اكتشاف بروتين Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Biology

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, including cell survival, proliferation, and differentiation. It is a reversible process that consists of a covalent attachment of ubiquitin to the substrate through a cascade reaction of at least three different enzymes, composed of E1 (Ubiquitin-activation enzyme), E2 (Ubiquitin-conjugating enzyme), and E3 (Ubiquitin-ligase enzyme). The E3 complex plays an important role in substrate recognition and ubiquitylation. Here, a protocol is described to evaluate substrate ubiquitylation in mammalian cells using transient co-transfection of a plasmid encoding the selected substrate, an E3 ubiquitin ligase, and a tagged ubiquitin. Before lysis, the transfected cells are treated with the proteasome inhibitor MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) to avoid substrate proteasomal degradation. Furthermore, the cell extract is submitted to small-scale immunoprecipitation (IP) to purify the polyubiquitylated substrate for subsequent detection by western blotting (WB) using specific antibodies for ubiquitin tag. Hence, a consistent and uncomplicated protocol for ubiquitylation assay in mammalian cells is described to assist scientists in addressing ubiquitylation of specific substrates and E3 ubiquitin ligases.

We provide a detailed protocol for a ubiquitylation assay of a specific substrate and an E3 ubiquitin-ligase in mammalian cells. HEK293T cell lines were used for protein overexpression, the polyubiquitylated substrate was purified from cell lysates by immunoprecipitation, and resolved in SDS-PAGE. Immunoblotting was used to visualize this post-translational modification.

تقييم الركيزة في كل مكان بواسطة E3 Ubiquitin-ligase في تحلل خلايا الثدييات

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, ...

<meta charset="utf8"></head><body>تقييم متغيرات DUB في اضطرابات النمو العصبي باستخدام مقايسة الانقسام

Measuring Enzymatic Activity of Neurodevelopmental Disorder-Associated Deubiquitylating Enzymes via an In Vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. Discrete disorders caused by single genes provide models to investigate mechanisms driving atypical neurodevelopment. Variants of genes encoding deubiquitylating enzyme (DUB) family proteins are associated with several NDDs, but there is a need to determine the pathogenic mechanisms of disorders driven by these gene variants. The impact of gene variants on DUB activity can be experimentally determined using a substrate-independent in vitro ubiquitin cleavage assay. This assay does not require knowledge of downstream substrates to directly measure catalytic activity. Here, the protocol for determining the impact of gene variants on enzymatic activity is modeled using the DUB Ubiquitin Specific Protease 27, X-linked (USP27X), which is mutated in X-linked intellectual disability 105 (XLID105). This experimental pipeline can be used to clarify the mechanisms underlying neurodevelopmental disorders driven by variants in DUB genes.

<meta charset="utf8"></head><body>قياس النشاط الأنزيمي لإنزيمات deubiquitylating المرتبطة باضطراب النمو العصبي عن طريق مقايسة انقسام سلسلة Ubiquitin في المختبر

This protocol explains how to measure the effect of genetic variation associated with neurodevelopmental disorders on deubiquitylating enzyme activity by combining recombinant protein purification with ubiquitin chain cleavage assays.

قياس النشاط الأنزيمي لإنزيمات deubiquitylating المرتبطة باضطراب النمو العصبي عن طريق مقايسة انقسام سلسلة Ubiquitin في المختبر

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. ...

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases in ubiquitin-proteasome activity are critical for synaptic plasticity and memory formation and aberrant changes in this system are associated with a variety of neurological, neurodegenerative and psychiatric disorders. One of the issues in studying ubiquitin-proteasome functioning in the brain is that it is present in all cellular compartments, in which the protein targets, functional role and mechanisms of regulation can vary widely. As a result, the ability to directly compare brain ubiquitin protein targeting and proteasome catalytic activity in different subcellular compartments within the same animal is critical for fully understanding how the UPS contributes to synaptic plasticity, memory and disease. The method described here allows collection of nuclear, cytoplasmic and crude synaptic fractions from the same rodent (rat) brain, followed by simultaneous quantification of proteasome catalytic activity (indirectly, providing activity of the proteasome core only) and linkage-specific ubiquitin protein tagging. Thus, the method can be used to directly compare subcellular changes in ubiquitin-proteasome activity in different brain regions in the same animal during synaptic plasticity, memory formation and different disease states. This method can also be used to assess the subcellular distribution and function of other proteins within the same animal.

This protocol is designed to efficiently quantify ubiquitin-proteasome system (UPS) activity in different cellular compartments of the rodent brain. Users are able to examine UPS functioning in nuclear, cytoplasmic and synaptic fractions in the same animal, reducing the amount of time and number of animals needed to perform these complex analyses.

قياس النشاط شبه الخلوي يوبيكويتين بروتياسوم في الدماغ القوارض

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...

Neuroscience

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, techniques for studying the regulatory mechanism of this system are essential to elucidating the cellular and molecular processes of the aforementioned diseases. The use of hemagglutinin derived ubiquitin probes outlined in this paper serves as a valuable tool for the study of this system. This paper details a method that enables the user to perform assays that give a direct visualization of deubiquitinating enzyme activity. Deubiquitinating enzymes control proteasomal degradation and share functional homology at their active sites, which allows the user to investigate the activity of multiple enzymes in one assay. Lysates are obtained through gentle mechanical cell disruption and incubated with active site directed probes. Functional enzymes are tagged with the probes while inactive enzymes remain unbound. By running this assay, the user obtains information on both the activity and potential expression of multiple deubiquitinating enzymes in a fast and easy manner. The current method is significantly more efficient than using individual antibodies for the predicted one hundred deubiquitinating enzymes in the human cell.

The current protocol details a method for measuring the activity of functionally homologous deubiquitinating enzymes. Specialized probes covalently modify the enzyme and allow for detection. This method holds the potential to identify new therapeutic targets.

طريقة لقياس آخر من Deubiquitinating الانزيمات في خطوط الخلايا وعينات الأنسجة

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

تحليل سلسلة يوبيكيتين من خلال رصد التفاعل الموازي

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

استخدام نظام إثراء إيمونوبريسيبيتيشن شاملة لتحديد ملف تعريف تعديل بوستترانسلاشونال ذاتية للبروتينات المستهدفة

الكشف عن مواقع اكتشاف البروتين من قبل إثراء الببتيد وقياس الطيف الكتلي

تنميط اوبيكويتين و اوبيكويتين-مثل التعديلات اللاحقة الانتقالية وتحديد التعديلات الهامه

اكتشاف بروتين Ubiquitination

تقييم الركيزة في كل مكان بواسطة E3 Ubiquitin-ligase في تحلل خلايا الثدييات

قياس النشاط الأنزيمي لإنزيمات deubiquitylating المرتبطة باضطراب النمو العصبي عن طريق مقايسة انقسام سلسلة Ubiquitin في المختبر

قياس النشاط الأنزيمي لإنزيمات deubiquitylating المرتبطة باضطراب النمو العصبي عن طريق مقايسة انقسام سلسلة Ubiquitin في المختبر

قياس النشاط الأنزيمي لإنزيمات deubiquitylating المرتبطة باضطراب النمو العصبي عن طريق مقايسة انقسام سلسلة Ubiquitin في المختبر

قياس النشاط شبه الخلوي يوبيكويتين بروتياسوم في الدماغ القوارض

طريقة لقياس آخر من Deubiquitinating الانزيمات في خطوط الخلايا وعينات الأنسجة