המחברים רוצים להודות סלין ג'נטי על עזרתה ביצירת כדורי הסלולר עם טיפול MG-132 כמתואר בתוצאות הייצוג ואליז Mommaerts עבור מתן כדורי E. coli בשימוש בפרוטוקול.

1. הכנת תקן פפטיד כבד
<ol><li>בהתאם לספק ואיכות הפפטידים הכבדים שנרכשו, יהיה צורך לדלל את הפפטידים הכבדים. פרוטוקול זה השתמש רצפי פפטיד שדווחו בטבלה 1, עם חומצת אמינו C-מסוף שונה ליצין(13C615N2-ליצין) או ארגינין (13C615N4-ארגנין).<ol>
<li>מערבבים את הפפטידים הכבדים, מדללים את התערובת עם 50% אצטוניטריל (ACN) כדי ליצור תערובת פפטיד עם כל פפטיד ב 10 מיקרומטר.</li>
		<li>צור aliquots של תערובת פפטיד ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנה לדוגמה
<ol><li>תמוגה לדוגמה הערה: יש לקחת בחשבון את היציבות של שרשראות ubiquitin במהלך הכנת מדגם. יש לשמור על דגימות ביולוגיות ומאגרים מצוננים ב-4 מעלות צלזיוס ולהוסיף דגימות למאגר ייצוב האוביקוויטין במהירות האפשרית.<ol>
<li>הכן פתרון של 1 M NH4HCO3 (אמוניום ביקרבונט) במים ולהתאים את ה- pH ל 8 באמצעות 1 M NaOH.</li>
		<li>הכינו פתרון של 200 מ"מ N-אתילמלימיד (NEM) במים.</li>
		<li>הכן מאגר ייצוב ubiquitin באמצעות 8 M אוריאה ב 50 mM NH4HCO3/10 mM NEM. מאגר ייצוב Ubiquitin חייב להיות מוכן טרי בכל פעם. הערה: פתרון 5 מ"ל של 8 M אוריאה ידרוש הרבה פחות מ 5 מ"ל של מים בהתחשב בהרחבת המים כאשר בתמיסה רוויה עם אוריאה. התראה: אין להכין את המאגר מעל 50 מעלות צלזיוס בשל הנטייה של אוריאה ליצור פוליאוריאה בטמפרטורות גבוהות.</li>
		<li>Resuspend המדגם הביולוגי להיחקר במאגר ייצוב ubiquitin מכוון 0.5 מיקרוגרם / μL של חלבון lyse התאים עם שיטה מתאימה עבור המדגם. שיטת sonication המורכבת שלושה פולסים 10 s עם סוניפייר ברנסון SFX 150 להגדיר בעוצמה של 70% עם 10 הפסקות על הקרח בין כל פעימה, שימש עבור קווי התא בפרוטוקול זה.</li>
		<li>דגימת צנטריפוגה ב 18,000 x g במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה שולחן.</li>
		<li>מעבירים את ה-supernatant לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי עם חלבון נמוך. דגימות ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס בשלב זה במידת הצורך.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת מדגם ופקדים
	<ol>
<li>אם הדגימות קפואות, מערבבים (למשל, עם תרמומיקסר) בזמן שהם מופשרים כדי להמיס במהירות את אוריאה. התראה: אין להשתמש בטמפרטורות מעל 50 °C (60 °F) בשל הנטייה של אוריאה ליצור פוליאוריאה בטמפרטורות גבוהות.</li>
		<li>דגימת צנטריפוגה ב 18,000 x g במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה שולחן.</li>
		<li>העבר 20 מיקרוגרם של מדגם לצינור מיקרוצנטריפוגה נמוך טרי ולהתאים את עוצמת הקול ל 50 μL עם מאגר ייצוב ubiquitin.</li>
		<li>צור פקד שלילי באמצעות נפח מנורמל של מאגר ייצוב ubiquitin (50 μL). במדגם זה, אין גרסה קלה של כל פפטיד צריך להיות נוכח, המאפשר תצפית של כל זיהום אור הנובע ספייק בפפטידים כבדים. פקד שלילי זה שימש גם לשמירת תזמון זמן של PRM המתואר בסעיף 3.1.</li>
		<li>שליטה חיובית נוצרה גם עם מאגר ייצוב ubiquitin ותוספת של סוגי שרשרת זמינים מסחרית לנפח מנורמל של מאגר ייצוב ubiquitin (50 μL). בדרך כלל, K63, K48 ו- M1 זמינים. בתוצאות הייצוגיות נוצלו 20 ng של K48, K63 ו- M1.</li>
	</ol></li>
	<li>הפחתה, אלקילציה ועיכול
	<ol>
<li>הכן פתרון של 50 מ"מ אמוניום ביקרבונט (NH4HCO3)במים ולהתאים את המדגם ל- pH = 8 עם 1 M NaOH.</li>
		<li>תרבות של E. coli גדל מרק LB היה צנטריפוגה 5,000 x g במשך 5 דקות כדי ליצור גלולה, אשר נשטף אז 2x עם PBS לפני ההשעיה במאגר ייצוב ubiquitin ב 5 מיקרוגרם / μL.</li>
		<li>הוסף 1 מיקרוגרם של E. coli lysate לכל מדגם ושליטה. פרוטוקול זה משתמש E. coli (DH10B), אבל כל lysate מורכב ללא ubiquitin ניתן להשתמש. שים לב כי אוביקוויטין משותף לכל האיקריוטים. הערה: שימוש במטריצת E. coli lysate מפחית את אובדן הפפטידים עקב הידבקות לא ספציפית בכלי פלסטיק. זה בולט במיוחד בשליטה השלילית או דגימות עם תכולת חלבון מוגבלת ויש לו השפעה חזקה על התצפית של K6312.</li>
		<li>הכן פתרון של 500 mM tris (2-carboxyethyl) פוספין (TCEP) במים כיתה MS (DTT יכול לשמש כחלופה).</li>
		<li>להפחית את הדגימות ואת הפקדים על ידי תוספת של TCEP לריכוז הסופי של 50 מ"מ. וורטקס בקצרה לפני הדגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT). אם נעשה שימוש ב- DTT, יש להעלות את הטמפרטורה ל- 50 °C (60 °F). התראה: אין להשתמש בטמפרטורות מעל 50 °C (60 °F) בשל הנטייה של אוריאה ליצור פוליאוריאה בטמפרטורות גבוהות.</li>
		<li>הכינו פתרון של 550 מ"מ כלורואקטמיד (CAA) ב- NH4HCO3. חנות בחושך.</li>
		<li>Alkylate דגימות ופקדים על ידי הוספת CAA לריכוז הסופי של 55 mM. וורטקס בקצרה לפני הדגירה במשך 20 דקות ב RT בחושך. הערה: CAA משמש במקום iodoacetamide כסוכן ההפחתה כדי להקטין את הסיכוי של שינוי carbamidomethyl כפול (114.0429) על שאריות ליצין להיות טועה עבור -GG שינוי (114.0429)13.</li>
		<li>הוסף אנדופטידאז LysC לדגימות ב 1:25 (w / w) יחס לתכולת החלבון. דגירה במשך 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>לדלל את הדגימות ואת הפקדים עם 200 μL של 50 מ"מ NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v / v).</li>
		<li>הוסף טריפסין לדגימות ב 1:25 w / w יחס לתכולת החלבון. דגירה עבור 12 שעות ב 37 °C (69 °F).</li>
		<li>הוסף 10% חומצה פורמית (FA) פתרון במים כיתה MS ביחס 1:10 v / v לכל מדגם מדגם ובקרה. בדוק כי pH הוא <3) לפני ניקוי C18 ולהוסיף חומצה פורמית יותר במידת הצורך.</li>
		<li>לכל דגימה ובקרה להוסיף 0.5 μL של תקן פפטיד כבד שנוצר בסעיף 1.</li>
	</ol></li>
	<li>ניקוי פפטיד
	<ol>
<li>מספר יצרנים מציעים C18 טיפים ניקוי או צלחות. בצע את הוראות היצרן עבור המוצר בשימוש, ופפטידים מיובשים בצנטריפוגה ואקום, מוכן לניתוח MS.</li>
	</ol></li>
</ol>3. ניתוח על ידי LC-MS / MS
<ol><li>בצע ניתוח PRM ראשוני על תקן פפטיד כבד בצורה לא מתוכננת.<ol>
<li>Resuspend את הדגימות המיובשות ב 10 μL של מאגר טעינה MS 2% ACN / 0.05% חומצה trifluoroacetic (TFA).</li>
		<li>צייד HPLC בעמודה אנליטית שלב הפוך C18 (75 מיקרומטר x 15 ס"מ, 2 מיקרומטר 100 Å C18 חרוזים) המיועדת לננו זרימה MS. טופס הדרגתי ליניארי החלפת מים בדרגת MS בתוספת 0.1% FA עם ACN המכיל 0.1% FA. עמודת מלכודת הקרבה (75 מיקרומטר x 2 ס"מ, 3 מיקרומטר, 100 Å C18 חרוזים) כדי לשמר את חיי העמודה האנליטית שימשה כאן אך אינה נדרשת.</li>
		<li>תצמד את התפוקה של העמודה האנליטית למקור ננו-ESI בספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה.</li>
		<li>השתמש בשיטת פרוטאומיקה ממוקדת מתאימה עבור ספקטרומטר המסה. לדוגמה, בשיטת Q-Exactive פלוס שיטת שני ניסויים, יש לעבור בין MS מלא לניסוי PRM. עבור הניסוי MS מלא, רזולוציה של 120,000 עם יעד AGC של 1e6 ו 240 ms כמו ה-IT המרבי שימש. עבור ניסוי PRM, נעשה שימוש באותו יעד AGC וב- IT מרבי ברזולוציה נמוכה יותר של 60,000 וחלון בידוד של 1.2 m/z.</li>
		<li>הזרק 200 ng של הפקד השלילי על העמודה האנליטית באמצעות דגימה אוטומטית HPLC. החל הדרגתי ליניארי על המדגם בעמודה האנליטית הגדלת ריכוז ACN מ 2-25% על פני תקופה של ~ 45 דקות. הערה: ריכוז ACN 25% נמוך מהרגיל עבור פרוטאומיקה בשל האופי ההידרופילי הנמוך של פפטידים טיפוסיים האופייניים לטופולוגיית אוביקוויטין. אם פפטידים אחרים יש לכמת, ריכוז ACN גבוה יותר עשוי להיות הרצוי כדי להשיג הפרדת יעד טובה.</li>
		<li>נתח את תוצאות הפעלת התזמון כמתואר בסעיף 4.2 כדי ליצור רשימת כלילה מתוזמנת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניתוח הדגימות<ol>
<li>הפעל את הדוגמאות הנותרות כמתואר עבור התזמון ב- 3.1 מלבד השימוש ברשימת ההכללה המתוזמנת שנוצרה בסעיף 4.2. הערה: יש להפעיל ריק לאחר הפקד החיובי כדי להבטיח שלא יתגלה מסירה מההפעלה הקודמת בדגימות הבאות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ניתוח תוכנה
<ol><li>צור רשימת כלילה של עיצוב מתאים עבור MS מנוצל. פרוטוקול זה השתמש בתוכנת הקוד הפתוח Skyline (גירסה 19.1.0.193) (https://skyline.ms), המציעה תמיכה ועזרה מתועדות היטב. ניתן ליצור רשימת כלילה עבור מספר ספקטרומטרים של מסה באמצעות מתקן רשימת בידוד הייצוא.<ol>
<li>פתח מסמך קו רקיע חדש.</li>
		<li>בחר שינויים כבדים איזוטופ בהתאם לצורך פפטידים אופייניים טופולוגיה כבדה. בהגדרות| הגדרות פפטיד תחת הכרטיסיה שינוי, לחץ על שדה השם כדי לראות את השינוי הפוטנציאלי. הבחירה מבוססת על המצב האיזוטופי של הפפטידים הכבדים שנרכשו. בדוגמה זו, פפטידים סינתטיים הנושאים לידין כבד (13C615N2-לידין) או ארגינין כבד (13C615N4-ארגנין) ב C-terminus שימשו. התוויות המתאימות יהיו: "תווית:13C(6)15N(2) (C-מונח K)" ו"תווית:13C(6)15N(4) (C-מונח R)".</li>
		<li>בחר הגדרות| מעבר . תחת הכרטיסיה מסנן כוללים חיובים מבשר 2, 3, 4.</li>
		<li>הוסף פפטידים על-ידי בחירה באפשרות ערוך| הוסף| פפטידים.</li>
		<li>מלאו את התחומים הרלוונטיים, כולל רצף הפפטיד האופייני לטופולוגיה ושם חלבון (למשל, "שרשרת–K63").</li>
		<li>הרחיבו כל פפטיד המוצג כעת בחלונית 'מטרות'. מחק מצבי חיוב לא רצויים. מצב הטעינה המועדף ואנרגיית התנגשות, אשר עשויים להיות שונים בהתבסס על ספקטרומטר מסה בשימוש, עבור כל פפטיד טופולוגי אופייני מוצג בטבלה 1.</li>
		<li>עבור כל פפטיד האופייני לטופולוגיה (למעט M1 שבו GG נכלל ברצף) לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הרצף ובחר שנה. הוסף GG כשינוי מבני על-ידי לחיצה על שדה השם ובחירה באפשרות <הצג את כל... > לפני בחירת "גליגלי (K)".</li>
		<li>יצא את קובץ רשימת הבידוד| יצא| רשימת בידוד, בחר את סוג הכלי והגדר את סוג פעולת השירות כ רגיל. בחירה בלחצן אישור תפתח בקשה לשמירת קובץ *.csv בו ניתן להשתמש כדי ליצור פעולת שירות PRM.</li>
	</ol></li>
	<li>צור רשימת כלילה מתוזמנת המבוססת על הפעלת תזמון פפטיד כבדה המוסברת כאן באמצעות תוכנת קו הרקיע בקוד פתוח.<ol>
<li>צור רשימת יעד כמתואר בסעיף 4.1.</li>
		<li>יבא את הפעלת התזמון ב- 3.1 על-ידי בחירה באפשרות קובץ| ייבוא| תוצאות .</li>
		<li>סקור את הזיהויים. האות הכבד עבור כל פפטיד ניתן לצפייה על ידי לחיצה על המסה עבור כל כניסת פפטיד כבדה. זיהוי נכון של השיא נקבע לעתים קרובות באופן אוטומטי, אך התוכנה עשויה לדרוש אוצרות ידנית על-ידי בחירת השיא באמצעות לחיצה וגרירה מתחת לציר ה- x.</li>
		<li>זמני השמירה שנבחרו עבור הווריאנטים הכבדים חלים גם על הגירסאות המוארות, ובכך יוצרים לוח זמנים עבור PRM. ניתן לשנות את חלון התזמון תחת הגדרות| הגדרות פפטיד באמצעות הכרטיסיה חיזוי, על-ידי שינוי חלון הזמן.</li>
		<li>כעת ניתן לייצא רשימת כלילה מתוזמנת באמצעות קובץ| יצא| רשימת בידוד ובחירת סוג הכלי המתאים והגדרת סוג פעולת השירות לתזמון.</li>
	</ol></li>
	<li>נתח את הנתונים.<ol>
<li>יבא את הדגימות באותו אופן כמו עבור ניתוח הפעלת התזמון בסעיף 4.2.</li>
		<li>לאחר הייבוא המלא של כל הדגימות, מומלץ לאצור מעברים. זהו התהליך שבאמצעותו מוסרים מעברים עם הפרעה או יחסי אות לרעש ירודים. דוגמה לכרומטוגרמה לפני ואחרי אוצרות מוצגת באיור 4.</li>
		<li>כעת ניתן לייצא נתונים על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על גרפים רלוונטיים ובחירת העתקת נתונים או על-ידי בחירת קובץ| יצא| תוצאות .</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+post-translational+modification+statistics:+frequency+analysis+and+curation+of+the+swiss-prot+database.">Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database.</a> Scientific Reports. 1, 90 (2011).</li><li>Goldstein, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+polypeptide+that+has+lymphocyte-differentiating+properties+and+is+probably+represented+universally+in+living+cells.">Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (1), 11-15 (1975).</li><li>Glickman, M. H., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway:+Destruction+for+the+sake+of+construction.">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: Destruction for the sake of construction.</a> Physiol. Rev. 82, 373-428 (2002).</li><li>Pickart, C. M., Eddins, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin:+structures,+functions,+mechanisms.">Ubiquitin: structures, functions, mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1695 (1-3), 55-72 (2004).</li><li>Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+diversity+at+a+glance.">Ubiquitin chain diversity at a glance.</a> Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).</li><li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+Code.">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li><li>Mattern, M., Sutherland, J., Kadimisetty, K., Barrio, R., Rodriguez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Ubiquitin+Binders+to+Decipher+the+Ubiquitin+Code.">Using Ubiquitin Binders to Decipher the Ubiquitin Code.</a> Trends in Biochemical Sciences. 44 (7), 599-615 (2019).</li><li>Newton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+editing+revealed+by+polyubiquitin+linkage-specific+antibodies.">Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies.</a> Cell. 134 (4), 668-678 (2008).</li><li>Spence, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle-regulated+modification+of+the+ribosome+by+a+variant+multiubiquitin+chain.">Cell cycle-regulated modification of the ribosome by a variant multiubiquitin chain.</a> Cell. 102 (1), 67-76 (2000).</li><li>Borr&#224;s, E., Sabid&#243;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+targeted+proteomics?+A+concise+revision+of+targeted+acquisition+and+targeted+data+analysis+in+mass+spectrometry.">What is targeted proteomics? A concise revision of targeted acquisition and targeted data analysis in mass spectrometry.</a> PROTEOMICS. 17 (17-18), (2017).</li><li>Lesur, A., Domon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+high-resolution+accurate+mass+spectrometry+application+to+targeted+proteomics.">Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics.</a> PROTEOMICS. 15 (5-6), 880-890 (2015).</li><li>Longworth, J., Dittmar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Ubiquitin+Chain+Topology+by+Targeted+Mass+Spectrometry.">Assessment of Ubiquitin Chain Topology by Targeted Mass Spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1977, 25-34 (2019).</li><li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry.">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li><li>Tawa, N. E., Odessey, R., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+proteasome+reduce+the+accelerated+proteolysis+in+atrophying+rat+skeletal+muscles.">Inhibitors of the proteasome reduce the accelerated proteolysis in atrophying rat skeletal muscles.</a> The Journal of Clinical Investigation. 100 (1), 197-203 (1997).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Collision+Energy+Optimization+on+the+Measurement+of+Peptides+by+Selected+Reaction+Monitoring+(SRM)+Mass+Spectrometry.">Effect of Collision Energy Optimization on the Measurement of Peptides by Selected Reaction Monitoring (SRM) Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82 (24), 10116-10124 (2010).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

ניתוח של מצב ubiquitin בתוך פרוטאום הוא בעל חשיבות גוברת למגוון רחב של שאלות ביולוגיות. התיאור של מצב ubiquitination של מדגם חייב להתמקד לא רק על הפרופיל של חלבונים להיות ubiquitinated, אלא גם על הטופולוגיה של ubiquitination כזה. להערכת טופולוגיה זו על ידי טרשת נפוצה ממוקדת, כמתואר כאן, יש תפקיד במגוון רחב של חקירות...

הרגולציה ההדוקה של תפקוד החלבון ויציבות היא בעלת חשיבות עליונה, שכן הם מניעים עיקריים של שליטה פנוטיפית בביולוגיה. תפקידו של חלבון בנוי משני מרכיבים: רצף הפוליפפטיד המהותי שלו וכל שינוי פוסט-טרנסלציה (PTMs). זוהו PTMs כימיים שונים כולל גליקוסילציה, זרחון, אצטילציה ומתילציה1. בשנת 1975 זיהה גולדשטיין ואח'2 חלבון קטן וקרא לו אוביקוויטין בשל אופיו בכל מקום. אוביקוויטין נמצאה חשובה בהשפלת חלבונים3. עם זאת, מאז נקבע כי הפונקציה של ubiquitin כמו מולקולת איתות משתרע הרבה מעבר ויסות יציבות החלבון. איתות Ubiquitin מעורב במגוון רחב של פונקציות ביולוגיות אחרות, כגון ייצוב חלבון, autophagy, בקרת מחזור התא, וסחר בחלבון4.
בעוד PTMs אחרים הם בדרך כלל בינארי (כלומר, החלבון משתנה או נשאר ללא שינוי) עבור אתר נתון, ubiquitin יכול לשנות חלבון הן כמונומר או כשרשרת פולימרית, עם ubiquitin המצורף עצמו להיות ubiquitinated. יתר על כן, שרשרת פוליוביקוויטין זו יכולה להתפתח במספר טופולוגיות עם ubiquitination של ubiquitin הקודם הצמדה לאחד משמונה אתרי קישור5,6. אוביקוויטין מועבר על ידי תהליך אנזימטי רב-שלבי (איור 1) שבו מסוף C של אוביקוויטין מקושר לאחד משבעת שאריות הליצין שלו (K06, K11, K27, K29, K33, K48 או K63) או מסוף N של האוביקוויטין הקודם (המכונה M1 או ubiquitination ליניארי)5,6. טופולוגיית שרשרת זו היא המפתח לגורל החלבון תחת שינוי. לדוגמה, השינוי בשרשרת מקושרת K48 או K11 מוביל לפגיעה בחלבון שהשתנה בפרוטאזום, בעוד ששרשרת ליניארית נחוצה להפעלת איתות NF-kB. לפיכך, ההפצה היחסית של טופולוגיות שרשרת אלה רלוונטית למגוון רחב של שאלות ביולוגיות.
השימוש בספקטרומטריית מסה (MS) הוא יתרון מיוחד לניתוח טופולוגיית שרשרת אוביקוויטין מכיוון שהוא אינו מסתמך על אינטראקציות מבוססות נוגדנים או מבוססות זיקה7,8, שרבות מהן ספציפיות מוגבלות ואינן מבדילות בין סוגי השרשרת השונים. אפשרות זיהוי שונה היא שימוש במוטנטים אוביקוויטין מהונדסים גנטית. כאן, ליבין מסוים מוחלף ארגינין, אשר לא יכול לתמוך בשינוי על ידי ubiquitin. חוסר היווצרות שרשרת ubiquitin על חלבון המצע מתפרש לאחר מכן כעדות לטופולוגיה ספציפית9.
זיהוי מבוסס MS של חלבונים ubiquitinated מבוסס על העובדה כי C-מסוף של ubiquitin מכיל שאריות ארגינין בתנוחה 74 כי הוא מוכר על ידי טריפסין במהלך ההכנה הפרוטאוליטית של הדגימות לניתוח טרשת נפוצה, הפרדת גליצין כפול C-מסוף. גליגלי (-GG) זה נשאר מחובר לקבוצה ε אמינו של שאריות ליצין של חלבון המצע. עבור ניתוח טופולוגית ubiquitin, השינוי מתרחשת על אחד משבעת שאריות ליצין של אוביקוויטין. פעולה זו יוצרת קבוצה של שבעה פפטידים מרכזיים הנושאים שאריות ליצין שמשתנות על-ידי GG, ספציפיות לכל אחת מהטופולוגיות (איור 2). לדוגמה, עם טופולוגיית K06, ליצין במיקום 6 על רצף חומצות אמינו יהיה מוגן מפני עיכול טריפטי עם -GG שינוי של 114 Da הוסיף ליצין זה.
זיהוי של פפטידים מוגדרים מראש ספציפיים על ידי טרשת נפוצה נקרא פרוטאומיקה ממוקדת, או ליתר דיוק, רכישת פפטידממוקדת 10. שתי שיטות פותחו בהתאם לביצועים של ספקטרומטר המסה בשימוש. אלה הם ניטור תגובה נבחר (SRM), המכונה גם ניטור תגובה מרובה (MRM), וניטור תגובה מקבילה (PRM). SRM כרוך בבחירת המעברים המורכבים מהמבשר m/z ומהיון המוצר m/z. לעומת זאת, PRM דורש רק את המבשר m/z. לאחר הבחירה, מתבצעת סריקת סקר מלאה של יוני המוצר. זה יש את היתרון כי אין מבחר של יוני מוצר מתאימים עבור כמויות על ספקטרומטר המסה הספציפי יש צורך לפני המדידה11. הן SRM והן PRM יכולים, בהתאם למכשיר, להיות מתוזמנים. תזמון הוא הנוהג של הקצאת חלון זמן שבמהלכו ייכלל יון מסוים לניתוח, שכן פפטידים מתרוממים בזמני שמירה מוגדרים מהמערכת הכרומטוגרפית. צמצום מספר היונים הנחקרים בכל זמן נתון מגדיל את תדירות החקירה של היונים המתוכננים באותה תקופה, ובכך משפר את דיוק הנתונים.
באופן כללי, היישום של פרוטאומיקה ממוקדת עבור טופולוגיית ubiquitin זהה לכל ניסוי פרוטאומיקה ממוקד אחר. עם זאת, שני הבדלים מרכזיים חשובים: ראשית, יש לשקול את היציבות של שרשראות ubiquitin. ישנם אנזימים deubiquitinating חזק מרובים (DUBs) כי במהירות להשפיל שרשראות על תמוגה התא. הפרוטאסות הספציפיות לאוביקוויטין מתחלקות לשתי קטגוריות, התיאסטרות והמתכות. רוב האוביקוויטין-הידרולאסות הן תיאסטראסים ונושאות שאריות ציסטאין במרכז הפעיל שלהן. על ידי alkylating שאריות ציסטאין זה, הם יכולים להיות מושבתים. ככזה, השימוש במאגרי ייצוב ubiquitin המכילים סוכני alkylating, כמו N-אתילמלימיד (NEM), וכימיקלים denaturing מאוד, ושמירה על דגימות מקורר חיוני לניתוח מוצלח. שנית, שלא כמו ניסויים ממוקדים אחרים, בחירת הפפטיד קבועה. בניסוי ממוקד טיפוסי, ניתן לבחור פפטיד פרוטאוטיפי לביצועים כרומטוגרפיים ויוניזציה טובים. עבור כמה פפטידים אופייניים טופולוגיה כגון K48 מאפיינים אלה טובים, ואילו עבור אחרים, הם פחות רצויים. לדוגמה, כרומטוגרפיה K33 בהגדרה הפוכה טיפוסית היא ירודה בשל היווצרות של פרופיל elution מתוח, ואת תכונות יינון לקוי של פפטיד K27 להפחית את הראות שלה על ידי MS12.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לבצע הערכה טופולוגית ubiquitin של מדגם ביולוגי על ידי PRM. נתונים לדוגמה עבור ההליך מוצגים באמצעות הפרעה של פרוטאזום באמצעות טיפול מעכב MG-132 במספר סוגי תאים שונים.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrile (ACN)</td><td>Merck</td><td>100029</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate (ABC)</td><td>Fluka</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 16</td><td></td></tr><tr><td>Chloroacetamide (CAA)</td><td>Sigma</td><td>22790</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid (FA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85178</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Peptides</td><td>JPT Peptide Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Dionex</td><td>Ulitimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>LC Column</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>160321</td><td></td></tr><tr><td>Lys C</td><td>Wako</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>Mass Spectrometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q-Exactive Plus</td><td></td></tr><tr><td>N-ethylmaleimide (NEM)</td><td>ACROS Organics</td><td>156100050</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Chain K48</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-240</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Chain K63</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-340-100</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Chain M1</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-710B-025</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier</td><td>Branson sonifier</td><td>SFX 150</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer Comfort</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td><td>Sigam</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>77720</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>V1511A</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>Waters &amp;mu;Elution C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt; plates</td><td>Waters</td><td>186002318</td><td></td></tr></tbody></table>

ubiquitin chain analysis by parallel reaction monitoring

הערכה של הפרופיל העולמי של טופולוגיות שרשרת ubiquitin בתוך פרוטאום הוא עניין לענות על מגוון רחב של שאלות ביולוגיות. הפרוטוקול המתואר כאן מנצל את השינוי di-גליצין (-GG) שנותר לאחר העיכול טריפטי של ubiquitin משולב בשרשרת. על ידי כימות אלה טופולוגיה אופייני פפטידים השפע היחסי של כל טופולוגיית שרשרת ubiquitin ניתן לקבוע. הצעדים הנדרשים לכימות פפטידים אלה על ידי ניסוי ניטור תגובה מקבילה מדווחים תוך התחשבות בייצוב של שרשראות ubiquitin. הכנת פקדים כבדים, תמוגת תאים ועיכול מתוארים יחד עם הגדרת ספקטרומטר המסה המתאימה וזרימת העבודה של ניתוח נתונים. ערכת נתונים לדוגמה עם הפרעות בטופולוגיית ubiquitin מוצגת, מלווה בדוגמאות כיצד מיטוב הפרוטוקול יכול להשפיע על התוצאות. על ידי ביצוע השלבים המתוארים, משתמש יוכל לבצע הערכה גלובלית של הנוף טופולוגית ubiquitin בתוך ההקשר הביולוגי שלהם.

כדי להדגים את השימוש בניתוח שרשרת ubiquitin על ידי PRM, שלושה קווי תאים נבחרו: קו תא מלנומה עכבר B16, ואת שני קווי התא האנושיים הנפוצים A549 (תאי אפיתל בסיסי מכתשי אדנוקרצ'ינו) ו HeLa (תאים סרטניים צוואר הרחם). תרבויות אלה גדלו לשלב midexponential במדיה המתאימה לפני שטופלו 0, 10, או 100 מ"מ MG-132 עבור 4 שעות לפני הקציר. ...

Watch this Scientific Journal Video about Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring at JoVE.com

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

שיטה זו מתארת הערכה של שינויים גלובליים בטופולוגיית שרשרת ubiquitin. ההערכה מבוצעת על ידי יישום של גישה פרוטאומית ממוקדת ספקטרומטריית מסה.

ניתוח שרשרת Ubiquitin על ידי ניטור תגובה מקבילה

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

ubiquitin-chain-analysis-by-parallel-reaction-monitoring

Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.5K Views.  Luxembourg Institute of Health. שיטה זו מתארת הערכה של שינויים גלובליים בטופולוגיית שרשרת ubiquitin. ההערכה מבוצעת על ידי יישום של גישה פרוטאומית ממוקדת ספקטרומטריית מסה.

Video: Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which may be essential for a given protein&#39;s role both physiologically and pathologically. Enrichment of PTMs is often necessary when investigating the PTM status of a target protein, because PTMs are often transient and relatively low in abundance. Many pitfalls are encountered when enriching for a PTM of a target protein, such as buffer incompatibility, the target protein antibody is not IP-compatible, loss of PTM signal, and others. The degree of difficulty is magnified when investigating multiple PTMs like acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, and tyrosine phosphorylation for a given target protein. Studying a combination of these PTMs may be necessary, as crosstalk between PTMs is prevalent and critical for protein regulation. Often, these PTMs are studied in different lysis buffers and with unique inhibitor compositions. To simplify the process, a unique denaturing lysis system was developed that effectively isolates and preserves these four PTMs; thus, enabling investigation of potential crosstalk in a single lysis system. A unique filter system was engineered to remove contaminating genomic DNA from the lysate, which is a problematic by-product of denaturing buffers. Robust affinity matrices targeting each of the four PTMs were developed in concert with the buffer system to maximize the enrichment and detection of the endogenous states of these four PTMs. This comprehensive PTM detection toolset streamlines the process of obtaining critical information about whether a protein is modified by one or more of these PTMs.

Investigating multiple, endogenous post-translational modifications for a target protein can be extremely challenging. Techniques described here utilize an optimized lysis buffer and filter system developed with specific PTM-targeting, affinity matrices to detect the acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, and tyrosine phosphorylation modifications for a target protein using a single, streamlined system.

ניצול מערכת העשרה Immunoprecipitation מקיף כדי לזהות פרופיל אנדוגני שינוי Post-translational של חלבונים היעד

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

יצירת פרופיל אוביקוויפין ואוביקוויב-שינויים עצמאיים וזיהוי של שינויים משמעותיים

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

זיהוי של חלבון Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Biology

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, including cell survival, proliferation, and differentiation. It is a reversible process that consists of a covalent attachment of ubiquitin to the substrate through a cascade reaction of at least three different enzymes, composed of E1 (Ubiquitin-activation enzyme), E2 (Ubiquitin-conjugating enzyme), and E3 (Ubiquitin-ligase enzyme). The E3 complex plays an important role in substrate recognition and ubiquitylation. Here, a protocol is described to evaluate substrate ubiquitylation in mammalian cells using transient co-transfection of a plasmid encoding the selected substrate, an E3 ubiquitin ligase, and a tagged ubiquitin. Before lysis, the transfected cells are treated with the proteasome inhibitor MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) to avoid substrate proteasomal degradation. Furthermore, the cell extract is submitted to small-scale immunoprecipitation (IP) to purify the polyubiquitylated substrate for subsequent detection by western blotting (WB) using specific antibodies for ubiquitin tag. Hence, a consistent and uncomplicated protocol for ubiquitylation assay in mammalian cells is described to assist scientists in addressing ubiquitylation of specific substrates and E3 ubiquitin ligases.

We provide a detailed protocol for a ubiquitylation assay of a specific substrate and an E3 ubiquitin-ligase in mammalian cells. HEK293T cell lines were used for protein overexpression, the polyubiquitylated substrate was purified from cell lysates by immunoprecipitation, and resolved in SDS-PAGE. Immunoblotting was used to visualize this post-translational modification.

הערכה של יוביקוויטילציה של מצע על ידי E3 יוביקוויטין-ליגאז בליסאטים של תאי יונקים

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, ...

<meta charset="utf8"></head><body>הערכת וריאנטים של DUB בהפרעות נוירו-התפתחותיות באמצעות בדיקת מחשוף

Measuring Enzymatic Activity of Neurodevelopmental Disorder-Associated Deubiquitylating Enzymes via an In Vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. Discrete disorders caused by single genes provide models to investigate mechanisms driving atypical neurodevelopment. Variants of genes encoding deubiquitylating enzyme (DUB) family proteins are associated with several NDDs, but there is a need to determine the pathogenic mechanisms of disorders driven by these gene variants. The impact of gene variants on DUB activity can be experimentally determined using a substrate-independent in vitro ubiquitin cleavage assay. This assay does not require knowledge of downstream substrates to directly measure catalytic activity. Here, the protocol for determining the impact of gene variants on enzymatic activity is modeled using the DUB Ubiquitin Specific Protease 27, X-linked (USP27X), which is mutated in X-linked intellectual disability 105 (XLID105). This experimental pipeline can be used to clarify the mechanisms underlying neurodevelopmental disorders driven by variants in DUB genes.

<meta charset="utf8"></head><body>מדידת הפעילות האנזימטית של אנזימים דאוביקוויטילציה הקשורים להפרעה נוירו-התפתחותית באמצעות בדיקת מחשוף שרשרת יוביקוויטין במבחנה

This protocol explains how to measure the effect of genetic variation associated with neurodevelopmental disorders on deubiquitylating enzyme activity by combining recombinant protein purification with ubiquitin chain cleavage assays.

מדידת הפעילות האנזימטית של אנזימים דאוביקוויטילציה הקשורים להפרעה נוירו-התפתחותית באמצעות בדיקת מחשוף שרשרת יוביקוויטין במבחנה

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. ...

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases in ubiquitin-proteasome activity are critical for synaptic plasticity and memory formation and aberrant changes in this system are associated with a variety of neurological, neurodegenerative and psychiatric disorders. One of the issues in studying ubiquitin-proteasome functioning in the brain is that it is present in all cellular compartments, in which the protein targets, functional role and mechanisms of regulation can vary widely. As a result, the ability to directly compare brain ubiquitin protein targeting and proteasome catalytic activity in different subcellular compartments within the same animal is critical for fully understanding how the UPS contributes to synaptic plasticity, memory and disease. The method described here allows collection of nuclear, cytoplasmic and crude synaptic fractions from the same rodent (rat) brain, followed by simultaneous quantification of proteasome catalytic activity (indirectly, providing activity of the proteasome core only) and linkage-specific ubiquitin protein tagging. Thus, the method can be used to directly compare subcellular changes in ubiquitin-proteasome activity in different brain regions in the same animal during synaptic plasticity, memory formation and different disease states. This method can also be used to assess the subcellular distribution and function of other proteins within the same animal.

This protocol is designed to efficiently quantify ubiquitin-proteasome system (UPS) activity in different cellular compartments of the rodent brain. Users are able to examine UPS functioning in nuclear, cytoplasmic and synaptic fractions in the same animal, reducing the amount of time and number of animals needed to perform these complex analyses.

בדיקת כימות משנית אוביקוויאין-פעילות פרוטאסדום במוח מכרסם

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...

Neuroscience

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, techniques for studying the regulatory mechanism of this system are essential to elucidating the cellular and molecular processes of the aforementioned diseases. The use of hemagglutinin derived ubiquitin probes outlined in this paper serves as a valuable tool for the study of this system. This paper details a method that enables the user to perform assays that give a direct visualization of deubiquitinating enzyme activity. Deubiquitinating enzymes control proteasomal degradation and share functional homology at their active sites, which allows the user to investigate the activity of multiple enzymes in one assay. Lysates are obtained through gentle mechanical cell disruption and incubated with active site directed probes. Functional enzymes are tagged with the probes while inactive enzymes remain unbound. By running this assay, the user obtains information on both the activity and potential expression of multiple deubiquitinating enzymes in a fast and easy manner. The current method is significantly more efficient than using individual antibodies for the predicted one hundred deubiquitinating enzymes in the human cell.

The current protocol details a method for measuring the activity of functionally homologous deubiquitinating enzymes. Specialized probes covalently modify the enzyme and allow for detection. This method holds the potential to identify new therapeutic targets.

שיטה למדידת הפעילות של אנזימי Deubiquitinating בשורות תאים ודגימות רקמה

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

ניתוח שרשרת Ubiquitin על ידי ניטור תגובה מקבילה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ניצול מערכת העשרה Immunoprecipitation מקיף כדי לזהות פרופיל אנדוגני שינוי Post-translational של חלבונים היעד

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

יצירת פרופיל אוביקוויפין ואוביקוויב-שינויים עצמאיים וזיהוי של שינויים משמעותיים

זיהוי של חלבון Ubiquitination

הערכה של יוביקוויטילציה של מצע על ידי E3 יוביקוויטין-ליגאז בליסאטים של תאי יונקים

מדידת הפעילות האנזימטית של אנזימים דאוביקוויטילציה הקשורים להפרעה נוירו-התפתחותית באמצעות בדיקת מחשוף שרשרת יוביקוויטין במבחנה

מדידת הפעילות האנזימטית של אנזימים דאוביקוויטילציה הקשורים להפרעה נוירו-התפתחותית באמצעות בדיקת מחשוף שרשרת יוביקוויטין במבחנה

מדידת הפעילות האנזימטית של אנזימים דאוביקוויטילציה הקשורים להפרעה נוירו-התפתחותית באמצעות בדיקת מחשוף שרשרת יוביקוויטין במבחנה

בדיקת כימות משנית אוביקוויאין-פעילות פרוטאסדום במוח מכרסם

שיטה למדידת הפעילות של אנזימי Deubiquitinating בשורות תאים ודגימות רקמה