Yazarlar, temsili sonuçlarda açıklandığı gibi MG-132 tedavisi ile hücresel peletlerin oluşturulmasındaki yardımı için Céline Jeanty'ye ve protokolde kullanılan E. coli peletlerini temini için Elise Mommaerts'e teşekkür etmek istiyor.

1. Ağır peptit standardının hazırlanması
<ol><li>Satın alınan ağır peptitlerin tedarikçisine ve kalitesine bağlı olarak, ağır peptitlerin seyreltilmesi gerekecektir. Bu protokol, Tablo 1'de bildirilen peptit dizilerini, Lizin (13C6 15 N2-lizin) veya Arginin(13C615 N4-arginin) olarak değiştirilmişC-terminalamino asit ile birlikte kullandı.<ol>
<li>Ağır peptitleri karıştırın, karışımı% 50 asetonitril (ACN) ile seyrelterek her peptitle 10 μM'de bir peptit karışımı oluşturun.</li>
		<li>Peptit karışımının aliquotlarını oluşturun ve -80 ° C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Numune hazırlama
<ol><li>Örnek lizis NOT: Numune hazırlama sırasında ubiquitin zincirlerinin stabilitesi göz önünde bulundurulmalıdır. Biyolojik numuneleri ve tamponları 4 °C'de soğutun ve numuneleri mümkün olduğunca hızlı bir şekilde ubiquitin stabilizasyon tamponu ekleyin.<ol>
<li>Suda 1 M NH4HCO3 (amonyum bikarbonat) çözeltisi hazırlayın ve 1 M NaOH kullanarak pH'ı 8'e ayarlayın.</li>
		<li>Suda 200 mM N-etilmelamid (NEM) çözeltisi hazırlayın.</li>
		<li>50 mM NH 4 HCO3/10 mM NEM'de8M üre kullanarak ubiquitin stabilizasyon tamponu hazırlayın. NOT: 8 M ürenin 5 mL'lik bir çözeltisi, üre ile doymuş bir çözeltideyken suyun genişlemesi göz önüne alındığında 5 mL'den daha az su gerektirecektir. DİkKAT: Ürenin yüksek sıcaklıklarda poliüre oluşturma eğilimi nedeniyle tamponu 50 °C'nin üzerinde hazırlamayın.</li>
		<li>0,5 μg/μL protein hedefleyen ubiquitin stabilizasyon tamponunda araştırılacak biyolojik numuneyi yeniden diriltmek ve hücreleri numune için uygun bir yöntemle üzmek. Bu protokoldeki hücre hatları için her darbe arasında buz üzerinde 10 s mola ile %70 şiddette ayarlanmış SFX 150 Branson sonifierli üç adet 10 sn darbeden oluşan sonication yöntemi kullanılmıştır.</li>
		<li>Masa üstü santrifüjde 4 °C'de 10 dakika boyunca 18.000 x g'da santrifüj örneği.</li>
		<li>Süpernatantı taze düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Numuneler gerekirse bu noktada -20 °C'de saklanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Numune ve kontrollerin hazırlanması
	<ol>
<li>Numuneler donmuşsa, üreyi hızla eritmek için çözülürken karıştırın (örneğin, bir termomikser ile). DİkKAT: Ürenin yüksek sıcaklıklarda poliüre oluşturma eğilimi nedeniyle 50 °C'nin üzerindeki sıcaklıkları kullanmayın.</li>
		<li>Masa üstü santrifüjde 4 °C'de 10 dakika boyunca 18.000 x g'da santrifüj örneği.</li>
		<li>20 μg numuneyi taze bir düşük bağlı mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve hacmi ubiquitin stabilizasyon tamponu ile 50 μL'ye ayarlayın.</li>
		<li>Normalleştirilmiş bir ubiquitin stabilizasyon tamponu (50 μL) hacmi kullanarak negatif bir kontrol oluşturun. Bu örnekte, her peptitin ışık versiyonu bulunmamalı ve bu da başaklı ağır peptitlerden kaynaklanan herhangi bir ışık kirlenmesinin gözlemlenmesine izin vermemelidir. Bu negatif kontrol, bölüm 3.1'de açıklanan PRM'nin saklama süresi zamanlaması için de kullanılmıştır.</li>
		<li>Ayrıca ubiquitin stabilizasyon tamponu ve normalleştirilmiş ubiquitin stabilizasyon tampon hacmine (50 μL) ticari olarak mevcut zincir tiplerinin eklenmesi ile pozitif bir kontrol oluşturuldu. Genellikle K63, K48 ve M1 mevcuttur. Temsili sonuçlarda 20 ng K48, K63 ve M1 kullanılmıştır.</li>
	</ol></li>
	<li>Azaltma, alkilasyon ve sindirim
	<ol>
<li>Suda 50 mM amonyum bikarbonat (NH4HCO3)çözeltisi hazırlayın ve numuneyi 1 M NaOH ile pH = 8 olarak ayarlayın.</li>
		<li>LB suyunda yetişen bir E. coli kültürü, bir pelet oluşturmak için 5 dakika boyunca 5.000 x g santrifüjlendi, daha sonra 5 μg / μL'de ubiquitin stabilizasyon tamponunda resüspenzyondan önce PBS ile 2x yıkandı.</li>
		<li>Her numuneye ve kontrole 1 μg E. coli lysate ekleyin. Bu protokol E. coli (DH10B) kullanır, ancak ubiquitin içermeyen herhangi bir karmaşık lisat kullanılabilir. Ubiquitin'in tüm ökaryotlar için ortak olduğunu unutmayın. NOT: E. coli lysate matrisi kullanmak, plastik eşyalara nonspesifik yapışma nedeniyle peptit kaybını azaltır. Bu özellikle negatif kontrolde veya sınırlı protein içeriğine sahip örneklerde fark edilir ve K6312'ningözlemi üzerinde güçlü bir etkiye sahiptir.</li>
		<li>MS sınıfı suda 500 mM tris (2-karboksitetil)fosfin (TCEP) çözeltisi hazırlayın (DTT alternatif olarak kullanılabilir).</li>
		<li>50 mM'lik son konsantrasyona TCEP ilavesi ile numuneleri ve kontrolleri azaltın. Oda sıcaklığında (RT) 30 dakika kuluçkaya yatırmadan önce kısa bir süre girdap. DTT kullanılırsa, sıcaklık 50 ° C'ye yükseltilmelidir. DİkKAT: Ürenin yüksek sıcaklıklarda poliüre oluşturma eğilimi nedeniyle 50 °C'nin üzerindeki sıcaklıkları kullanmayın.</li>
		<li>NH4HCO 3'te 550 mM kloroasetamid (CAA) çözeltisihazırlayın. Karanlıkta sakla.</li>
		<li>55 mM'lik son konsantrasyona CAA ekleyerek numuneleri ve kontrolleri alkillatın. Karanlıkta RT'de 20 dakika kuluçkaya yatırmadan önce Vortex kısa bir süre. NOT: CAA, bir lizin kalıntısında çift karbamidometil modifikasyon (114.0429) şansını azaltmak için azaltma maddesi olarak iodoasetamid yerine kullanılır -GG modifikasyonu (114.0429)13.</li>
		<li>Protein içeriğine 1:25 (w/w) oranında numunelere endopeptidaz LysC ekleyin. 37 °C'de 3 saat kuluçkaya yaslanın.</li>
		<li>Numuneleri ve kontrolleri 200 μL 50 mM NH 4 HCO3pH =8 (1:5 v/v) ile seyreltin.</li>
		<li>Protein içeriğine 1:25 w/w oranında trypsin ekleyin. 37 °C'de 12 saat kuluçkaya yaslanın.</li>
		<li>Her numuneye ve kontrol numunesine 1:10 oran v/v'de MS sınıfı suya %10 formik asit (FA) çözeltisi ekleyin. C18 temizliğinden önce pH'ın <3) olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse daha fazla formik asit ekleyin.</li>
		<li>Her numune ve kontrole bölüm 1'de oluşturulan ağır peptit standardının 0,5 μL'lik kısmını ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Peptit temizliği
	<ol>
<li>Çeşitli üreticiler C18 temizleme ipuçları veya plakaları sunar. Kullanılan ürün için üreticinin talimatlarını izleyin ve eluted peptitleri vakumlu santrifüjde kurutun, MS analizine hazır.</li>
	</ol></li>
</ol>3. LC-MS/MS tarafından analiz
<ol><li>Ağır peptit standardı üzerinde ilk PRM analizini planlanmamış bir şekilde gerçekleştirin.<ol>
<li>Kurutulmuş numuneleri 10 μL MS yükleme tamponunda %2 ACN/%0,05 trifluoroasetik asit (TFA) olarak yeniden sunun.</li>
		<li>Bir HPLC'yi nano akış ms. Form lineer gradyanları için tasarlanmış ters fazlı C 18 analitik sütun (75 μm x 15 cm,2 μm 100 şC 18 boncuk) ile donatın. Burada analitik sütunun ömrünü korumak için bir kurbanlık tuzak sütunu (75 μm x 2 cm, 3 μm,100 şC 18 boncuk) kullanılmıştır ancak gerekli değildir.</li>
		<li>Analitik sütunun çıkışını yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresinde bir nano-ESI kaynağıyla birleşin.</li>
		<li>Kütle spektrometresi için uygun bir hedefli proteomik yöntem kullanın. Örneğin, bir Q-Exactive artı iki deneme yönteminde, Tam MS ve PRM deneyi arasında geçiş yapın. Tam MS deneyi için, Maksimum BT olarak 1e6 ve 240 ms AGC hedefiyle 120.000 çözünürlük kullanıldı. PRM deneyi için, aynı AGC hedefi ve maksimum BT, 60.000 daha düşük çözünürlükte ve 1,2 m/z izolasyon penceresi ile kullanıldı.</li>
		<li>HPLC otomatik örnekleyiciyi kullanarak analitik sütuna 200 ng negatif kontrol enjekte edin. Analitik sütundaki örneğe doğrusal bir degrade uygulayın ve ~45 dakikalık bir süre boyunca ACN konsantrasyonunu %2-25 arasında artırın. NOT: Tipik ubiquitin topoloji karakteristik peptitlerin düşük hidrofilik doğası nedeniyle proteomik için % 25 ACN konsantrasyonu normalden daha düşüktür. Diğer peptitler ölçülecekse, iyi hedef ayrımı elde etmek için daha yüksek bir ACN konsantrasyonu isteilebilir.</li>
		<li>Zamanlanmış bir ekleme listesi oluşturmak için bölüm 4.2'de açıklandığı gibi zamanlama çalıştırmasının sonuçlarını çözümleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Örneklerin analizi<ol>
<li>Bölüm 4.2'de oluşturulan zamanlanmış ekleme listesinin kullanımı dışında, kalan örnekleri zamanlama için açıklandığı gibi 3.1'de çalıştırın. NOT: Sonraki örneklerde önceki çalıştırmadan taşıma algılanmamasını sağlamak için pozitif denetimden sonra bir boşluk çalıştırılmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Yazılım analizi
<ol><li>Kullanılan MS için uygun biçimlendirmenin bir ekleme listesini oluşturun. Bu protokol, iyi belgelenmiş destek ve yardım sunan açık kaynaklı Skyline (sürüm 19.1.0.193) (https://skyline.ms) kullandı. İhracat yalıtım listesi olanağı kullanılarak birkaç kütle spektrometresi için bir ekleme listesi oluşturulabilir.<ol>
<li>Yeni bir Skyline belgesi açın.</li>
		<li>Ağır topoloji karakteristik peptitlere uygun ağır izotop modifikasyonlarını seçin. Ayarlar'da| Değişiklik sekmesinin altındaki Peptit Ayarları, olası değişikliği görmek için ad alanına tıklayın. Seçim, satın alınan ağır peptitlerin izotopik durumuna dayanır. Bu örnekte, C-terminusunda ağır bir Lizin(13C615N 2-lizin) veya ağır bir Arginin(13C615N4-arginin) taşıyan sentetik peptitler kullanılmıştır. Uygun etiketler: "Etiket:13C(6)15N(2) (C-terim K)" ve "Etiket:13C(6)15N(4) (C-terim R)".</li>
		<li>Ayarlar'ı seçin| Geçiş. Filtre sekmesinin altında Öncül Ücretler 2, 3, 4bulunur.</li>
		<li>Düzenle'yi seçerek peptit ekleyin| Ekle| Peptitler.</li>
		<li>Topoloji-karakteristik peptit dizisi ve bir protein adı (örneğin, "Chain–K63") dahil olmak üzere ilgili alanları doldurun.</li>
		<li>Hedefler panelinde gösterilen her peptidi genişletin. istenmeyen ücret durumlarını silin. Her topoloji karakteristik peptit için kullanılan kütle spektrometresi temel alınarak farklılık gösterebilecek tercih edilen şarj durumu ve çarpışma enerjisi Tablo 1'degösterilmiştir.</li>
		<li>Her topoloji karakteristik peptit için (GG'nin sıraya dahil edildiği M1 hariç) sırayı sağ tıklatın ve Değiştir 'iseçin. Ad alanını tıklatıp <Tümünü göster'i seçerek yapısal bir değişiklik olarak GG ekleyin ... > "GlyGly (K)"yi seçmeden önce.</li>
		<li>Yalıtım listesi dosyasını verin| İhracat| Yalıtım Listesi, enstrüman türünü seçin ve yöntem türünü Standartolarak ayarlayın. Tamam seçildiğinde, PRM yöntemi oluşturmak için kullanılabilecek bir *.csv dosyasını kaydetmek için bir istem açılır.</li>
	</ol></li>
	<li>Açık kaynaklı Skyline yazılımı kullanılarak burada açıklanan ağır peptit zamanlama çalıştırmasına dayalı zamanlanmış bir ekleme listesi oluşturun.<ol>
<li>Bölüm 4.1'de açıklandığı gibi bir hedef liste oluşturun.</li>
		<li>Dosya'yı seçerek zamanlama çalıştırmasını 3.1'de içe aktarın| İçeri aktar| Sonuçlar.</li>
		<li>Kimlikleri gözden geçirin. Her peptit için ağır sinyal, her ağır peptit girişi için kütleye tıklayarak gözlemlenebilir. Tepenin doğru tanınması genellikle otomatik olarak belirlenir, ancak yazılım x ekseni altında tıklat ve sürükle'yi kullanarak tepe noktasını seçerek manuel kürasyon gerektirebilir.</li>
		<li>Ağır varyantlar için seçilen saklama süreleri hafif versiyonlara da uygulanır, böylece PRM için bir zamanlama oluşturulur. Zamanlama penceresi Ayarlar altında değiştirilebilir| Peptit Ayarları Tahmin sekmesini kullanarak, Zaman Penceresinideğiştirerek .</li>
		<li>Zamanlanmış bir ekleme listesi artık Dosya kullanılarak dışa aktarılabilir| İhracat| Yalıtım listesi ve uygun enstrüman türünü seçme ve yöntem türünü Zamanlanmış olarakayarlama .</li>
	</ol></li>
	<li>Verileri analiz edin.<ol>
<li>Örnekleri bölüm 4.2'deki zamanlama çalıştırması analiziyle aynı şekilde içe aktarın.</li>
		<li>Tüm örneklerin tamamen içe aktarilmesinden sonra, geçişlerin kürasyonu önerilir. Bu, parazit veya zayıf sinyal-gürültü oranlarıyla geçişlerin kaldırıldığı işlemdir. Kürasyondan önce ve sonra kromatogram örneği Şekil 4'te gösterilmiştir.</li>
		<li>Veriler artık ilgili grafiklere sağ tıklayıp Verileri kopyala'yı seçerek veya Dosya seçilerek dışa aktarılabilir| İhracat| Sonuçlar.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+post-translational+modification+statistics:+frequency+analysis+and+curation+of+the+swiss-prot+database.">Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database.</a> Scientific Reports. 1, 90 (2011).</li><li>Goldstein, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+polypeptide+that+has+lymphocyte-differentiating+properties+and+is+probably+represented+universally+in+living+cells.">Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (1), 11-15 (1975).</li><li>Glickman, M. H., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway:+Destruction+for+the+sake+of+construction.">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: Destruction for the sake of construction.</a> Physiol. Rev. 82, 373-428 (2002).</li><li>Pickart, C. M., Eddins, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin:+structures,+functions,+mechanisms.">Ubiquitin: structures, functions, mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1695 (1-3), 55-72 (2004).</li><li>Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+diversity+at+a+glance.">Ubiquitin chain diversity at a glance.</a> Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).</li><li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+Code.">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li><li>Mattern, M., Sutherland, J., Kadimisetty, K., Barrio, R., Rodriguez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Ubiquitin+Binders+to+Decipher+the+Ubiquitin+Code.">Using Ubiquitin Binders to Decipher the Ubiquitin Code.</a> Trends in Biochemical Sciences. 44 (7), 599-615 (2019).</li><li>Newton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+editing+revealed+by+polyubiquitin+linkage-specific+antibodies.">Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies.</a> Cell. 134 (4), 668-678 (2008).</li><li>Spence, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle-regulated+modification+of+the+ribosome+by+a+variant+multiubiquitin+chain.">Cell cycle-regulated modification of the ribosome by a variant multiubiquitin chain.</a> Cell. 102 (1), 67-76 (2000).</li><li>Borr&#224;s, E., Sabid&#243;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+targeted+proteomics?+A+concise+revision+of+targeted+acquisition+and+targeted+data+analysis+in+mass+spectrometry.">What is targeted proteomics? A concise revision of targeted acquisition and targeted data analysis in mass spectrometry.</a> PROTEOMICS. 17 (17-18), (2017).</li><li>Lesur, A., Domon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+high-resolution+accurate+mass+spectrometry+application+to+targeted+proteomics.">Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics.</a> PROTEOMICS. 15 (5-6), 880-890 (2015).</li><li>Longworth, J., Dittmar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Ubiquitin+Chain+Topology+by+Targeted+Mass+Spectrometry.">Assessment of Ubiquitin Chain Topology by Targeted Mass Spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1977, 25-34 (2019).</li><li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry.">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li><li>Tawa, N. E., Odessey, R., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+proteasome+reduce+the+accelerated+proteolysis+in+atrophying+rat+skeletal+muscles.">Inhibitors of the proteasome reduce the accelerated proteolysis in atrophying rat skeletal muscles.</a> The Journal of Clinical Investigation. 100 (1), 197-203 (1997).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Collision+Energy+Optimization+on+the+Measurement+of+Peptides+by+Selected+Reaction+Monitoring+(SRM)+Mass+Spectrometry.">Effect of Collision Energy Optimization on the Measurement of Peptides by Selected Reaction Monitoring (SRM) Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82 (24), 10116-10124 (2010).</li></ol>

Yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemektedir.

Bir proteom içindeki ubiquitin durumunun analizi, çok çeşitli biyolojik sorular için giderek daha fazla önem taşımaktadır. Bir örneğin her yerde bulunma durumunun tanımı sadece her yerde bulunan proteinlerin profiline değil, aynı zamanda bu tür her yerde bulunanların topolojisine de odaklanmalıdır. Bu topolojinin burada açıklandığı gibi hedeflenen MS tarafından değerlendirilmesi, çok çeşitli biyolojik araştırmalarda rol oynar.
Burada özetlenen protokolün küres...

Biyolojinin fenotipik kontrolünün başlıca iticileri oldukları için protein fonksiyonu ve stabilitesinin yakın düzenlenmesi son derece önemlidir. Bir proteinin işlevi iki bileşenden oluşturulur: içsel polipeptid dizisi ve herhangi bir posttranslational modifikasyon (PTM). Glikosilasyon, fosforilasyon, asetilasyon ve metilasyon1dahil olmak üzere çeşitli kimyasal PTM'ler tanımlanmıştır. 1975'te Goldstein ve ark.2 küçük bir protein tanımladı ve her yerde bulunan doğası nedeniyle her yerde olarak adlandırdı. Ubiquitin protein bozulmasında önemli bulunmuştur3. Bununla birlikte, o zamandan beri ubiquitin'in bir sinyal molekülü olarak işlevinin protein stabilitesinin düzenlenmesinin çok ötesine uzandığı tespit edilmiştir. Ubiquitin sinyali, protein stabilizasyonu, otofaji, hücre döngüsü kontrolü ve protein kaçakçılığı4gibi çok çeşitli diğer biyolojik işlevlerde yer almaktadır.
Diğer PTM'ler genellikle belirli bir site için ikili (yani protein modifiye edilir veya değiştirilmeden bırakılır) iken, ubiquitin bir proteini hem monomer hem de polimerik zincir olarak değiştirebilir ve ekli her yerde bulunur. Ayrıca, bu poliubiquitination zinciri, sekiz bağlantı sitesinden birine bağlı önceki ubiquitin'in her yerde bulunması ile çeşitli topolojilerde gelişebilir5,6. Ubiquitin, ubiquitin'in C-terminusunun yedi lizin kalıntılarından birine bağlı olduğu çok çeşitli enzip enzymatic bir işlemle transfer edilir (K06, K11, K27, K29, K33, K48 veya K63) veya önceki her yerde bulunanın N terminali (M1 veya doğrusal her yerde bulunma olarak adlandırılır)5,6. Bu zincir topolojisi, modifikasyonun altındaki proteinin kaderinin anahtarıdır. Örneğin, K48 veya K11 bağlantılı bir zincirle yapılan değişiklik, proteozomdaki değiştirilmiş proteinin bozulmasına yol açarken, NF-kB sinyalinin aktivasyonu için doğrusal bir zincir gereklidir. Bu nedenle, bu zincir topolojilerinin göreceli dağılımı çok çeşitli biyolojik sorularla ilgilidir.
Kütle spektrometresi (MS) kullanımı, antikor bazlı veya benzeşim tabanlı etkileşimlere dayanmadığı için her yerde zincir topoloji analizine özel bir fayda sağlar7,8, birçoğu sınırlı özgüllüğe sahiptir ve çeşitli zincir türleri arasında ayrım yapmaz. Farklı bir algılama olasılığı genetiği değiştirilmiş her yerde mutantlar kullanmaktır. Burada, belirli bir lizin, ubiquitin tarafından modifikasyonu destekleyemeyen arginin ile değiştirilir. Substrat proteininde ubiquitin zinciri oluşumunun olmaması daha sonra belirli bir topoloji için kanıt olarak yorumlanır9.
Her yerde bulunan proteinlerin MS tabanlı tanımlanması, ubiquitin C-terminusunun, MS analizi için numunelerin proteolitik hazırlanması sırasında tripsin tarafından tanınan ve C-terminal çift glisini ayıran 74 pozisyonunda bir arginin kalıntısı içermesi gerçeğine dayanmaktadır. Bu GlyGly (-GG), substrat proteininin lizin kalıntısının ε-amino grubuna bağlı kalır. Ubiquitin topoloji analizi için, modifikasyon ubiquitin yedi lizin kalıntılarından birinde meydana gelir. Bu, topolojilerin her birine özgü, GG tarafından değiştirilen bir lizin kalıntısı taşıyan yedi anahtar peptit kümesi oluşturur (Şekil 2). Örneğin, K06 topolojisi ile, amino asit dizisindeki 6 pozisyonundaki lizin, bu lizine eklenen 114 Da'nın -GG modifikasyonu ile triptik sindirimden korunacaktır.
MS tarafından önceden belirlenmiş belirli peptitlerin tanımlanması, hedeflenen proteomik veya daha spesifik olarak hedeflenen peptit alımı10olarak adlandırılır. Kullanılan kütle spektrometresinin performansına bağlı olarak iki yöntem geliştirilmiştir. Bunlar, çoklu reaksiyon izleme (MRM) ve paralel reaksiyon izleme (PRM) olarak da adlandırılan seçilmiş reaksiyon izlemedir (SRM). SRM, öncü m/z ve ürün iyon m/z'den oluşan geçişlerin seçimini içerir. Tersine, PRM yalnızca öncül m/z gerektirir. Seçim sonrası, ürün iyonlarının tam bir anket taraması yapılır. Bu, ölçüm11'denönce belirli kütle spektrometresinde nicellik için uygun ürün iyonlarının seçilmesinin gerekli olmaması avantajına sahiptir. Hem SRM hem de PRM, cihaza bağlı olarak zamanlanabilir. Planlama, peptitler kromatografik sistemden tanımlanmış saklama sürelerinde elde olduğu için, belirli bir iyonun analiz için dahil edileceğini bir zaman penceresi atama uygulamasıdır. Herhangi bir zamanda sorgulanan iyonların sayısını azaltmak, o sırada planlanan iyonların sorgulanma sıklığını arttırır, böylece veri doğruluğunu artırır.
Genel olarak, ubiquitin topolojisi için hedeflenen proteomik uygulaması, hedeflenen diğer proteomik deneylerle aynıdır. Bununla birlikte, iki temel fark önemlidir: Birincisi, her yerde bulunan zincirlerin stabilitesi göz önünde bulundurulmalıdır. Hücre lizisi üzerinde zincirleri hızla bozan birden fazla güçlü deubiquitinating enzim (DUB) vardır. Her yerde bulunan spesifik proteazlar iki kategoriye ayrılır: tiyoesterazlar ve metalloproteazlar. Ubiquitin-hidrolazların çoğu tiyoesterazdır ve aktif merkezlerinde sistein kalıntısı taşır. Bu sistein kalıntısını alklating atederek, inaktive edilebilirler. Bu nedenle, N-etirilimid (NEM) gibi alkilleştirici ajanlar içeren ubiquitin stabilizasyon tamponlarının ve yüksek oranda denatüre edici kimyasalların kullanılması ve numunelerin soğutulması başarılı bir analiz için hayati öneme sahiptir. İkincisi, diğer hedeflenen deneylerin aksine, peptit seçimi sabittir. Tipik bir hedefli deneyde, iyi kromatografik ve iyonlaşma performansı için proteotipik bir peptit seçilebilir. K48 gibi bazı topoloji karakteristik peptitler için bu özellikler iyidir, diğerleri için ise daha az arzu edilir. Örneğin, tipik bir ters faz kurulumunda K33 kromatografisi, gerilmiş bir elüsyon profilinin oluşumu nedeniyle zayıftır ve K27 peptidinin zayıf iyonlaşma özellikleri görünürlüğünü MS12azaltır.
Bu protokolde, PRM tarafından biyolojik bir numunenin ubiquitin topoloji değerlendirmesinin nasıl gerçekleştirildiğini açıklıyoruz. Prosedür için örnek veriler, birkaç farklı hücre tipinde MG-132 inhibitör tedavisi kullanılarak proteazomun pertürbasyonu kullanılarak sunulmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrile (ACN)</td><td>Merck</td><td>100029</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate (ABC)</td><td>Fluka</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 16</td><td></td></tr><tr><td>Chloroacetamide (CAA)</td><td>Sigma</td><td>22790</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid (FA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85178</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Peptides</td><td>JPT Peptide Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Dionex</td><td>Ulitimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>LC Column</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>160321</td><td></td></tr><tr><td>Lys C</td><td>Wako</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>Mass Spectrometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q-Exactive Plus</td><td></td></tr><tr><td>N-ethylmaleimide (NEM)</td><td>ACROS Organics</td><td>156100050</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Chain K48</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-240</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Chain K63</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-340-100</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Chain M1</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-710B-025</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier</td><td>Branson sonifier</td><td>SFX 150</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer Comfort</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td><td>Sigam</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>77720</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>V1511A</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>Waters &amp;mu;Elution C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt; plates</td><td>Waters</td><td>186002318</td><td></td></tr></tbody></table>

ubiquitin chain analysis by parallel reaction monitoring

Bir proteom içindeki her yerde bulunan zincir topolojilerinin küresel profilinin değerlendirilmesi, çok çeşitli biyolojik soruları yanıtlamak için ilgi çekicidir. Burada özetlenen protokol, bir zincire dahil edilen ubiquitin'in triptik sindirimi sonrasında kalan di-glisin (-GG) değişikliğinden yararlanır. Bu topoloji karakteristik peptitleri ölçerek her bir ubiquitin zincir topolojisinin göreceli bolluğu belirlenebilir. Bu peptitleri paralel reaksiyon izleme deneyi ile ölçmek için gereken adımlar, ubiquitin zincirlerinin stabilizasyonu dikkate alınarak bildirilmektedir. Ağır kontrollerin hazırlanması, hücre lizisi ve sindirim, uygun kütle spektrometresi kurulumu ve veri analizi iş akışı ile birlikte açıklanmaktadır. Protokolün en iyi duruma getirilmesi sonuçların nasıl etkileyebileceğine ilişkin örnekler eşliğinde, ubiquitin topolojisinde pertürbasyonlarla bir örnek veri kümesi sunulmaktadır. Bir kullanıcı, özetlenen adımları izleyerek, biyolojik bağlamı içinde her yerde bulunan topoloji manzarasının küresel bir değerlendirmesini gerçekleştirebilecektir.

PRM tarafından her yerde yapılan zincir analizinin kullanımını göstermek için üç hücre çizgisi seçildi: bir fare melanom hücre hattı B16 ve iki yaygın insan hücresi hattı A549 (adenokarsinomik alveolar bazal epitel hücreleri) ve HeLa (serviks kanseri hücreleri). Bu kültürler, hasat öncesinde 4 saat boyunca 0, 10 veya 100 mM MG-132 ile tedavi edilmeden önce uygun medyada midexponential faza büyüdü. MG-132, ubiquitin konjuge proteinlerin proteazom14tarafından bozulmasını...

Watch this Scientific Journal Video about Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring at JoVE.com

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Bu yöntem, ubiquitin zincir topolojislerindeki küresel değişikliklerin değerlendirilmesini açıklar. Değerlendirme, kütle spektrometresi tabanlı hedefli proteomik yaklaşımın uygulanmasıyla gerçekleştirilir.

Paralel Reaksiyon İzleme ile Ubiquitin Zincir Analizi

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

ubiquitin-chain-analysis-by-parallel-reaction-monitoring

Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.5K Görüntüleme.  Luxembourg Institute of Health. Bu yöntem, ubiquitin zincir topolojislerindeki küresel değişikliklerin değerlendirilmesini açıklar. Değerlendirme, kütle spektrometresi tabanlı hedefli proteomik yaklaşımın uygulanmasıyla gerçekleştirilir.

Video: Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which may be essential for a given protein&#39;s role both physiologically and pathologically. Enrichment of PTMs is often necessary when investigating the PTM status of a target protein, because PTMs are often transient and relatively low in abundance. Many pitfalls are encountered when enriching for a PTM of a target protein, such as buffer incompatibility, the target protein antibody is not IP-compatible, loss of PTM signal, and others. The degree of difficulty is magnified when investigating multiple PTMs like acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, and tyrosine phosphorylation for a given target protein. Studying a combination of these PTMs may be necessary, as crosstalk between PTMs is prevalent and critical for protein regulation. Often, these PTMs are studied in different lysis buffers and with unique inhibitor compositions. To simplify the process, a unique denaturing lysis system was developed that effectively isolates and preserves these four PTMs; thus, enabling investigation of potential crosstalk in a single lysis system. A unique filter system was engineered to remove contaminating genomic DNA from the lysate, which is a problematic by-product of denaturing buffers. Robust affinity matrices targeting each of the four PTMs were developed in concert with the buffer system to maximize the enrichment and detection of the endogenous states of these four PTMs. This comprehensive PTM detection toolset streamlines the process of obtaining critical information about whether a protein is modified by one or more of these PTMs.

Investigating multiple, endogenous post-translational modifications for a target protein can be extremely challenging. Techniques described here utilize an optimized lysis buffer and filter system developed with specific PTM-targeting, affinity matrices to detect the acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, and tyrosine phosphorylation modifications for a target protein using a single, streamlined system.

Bir endojen translasyonel modifikasyon profil hedef proteinler için tanımlamak için bir kapsamlı Immunoprecipitation zenginleştirme sistemi kullanan

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Biyokimya

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

Ubiquitin ve Ubiquitin benzeri Bağımlı Post-translational Modifikasyonlar ve Önemli Değişikliklerin Belirlenmesi Profilleme

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

Protein Ubikitinasyon Tespiti

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Biyoloji

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, including cell survival, proliferation, and differentiation. It is a reversible process that consists of a covalent attachment of ubiquitin to the substrate through a cascade reaction of at least three different enzymes, composed of E1 (Ubiquitin-activation enzyme), E2 (Ubiquitin-conjugating enzyme), and E3 (Ubiquitin-ligase enzyme). The E3 complex plays an important role in substrate recognition and ubiquitylation. Here, a protocol is described to evaluate substrate ubiquitylation in mammalian cells using transient co-transfection of a plasmid encoding the selected substrate, an E3 ubiquitin ligase, and a tagged ubiquitin. Before lysis, the transfected cells are treated with the proteasome inhibitor MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) to avoid substrate proteasomal degradation. Furthermore, the cell extract is submitted to small-scale immunoprecipitation (IP) to purify the polyubiquitylated substrate for subsequent detection by western blotting (WB) using specific antibodies for ubiquitin tag. Hence, a consistent and uncomplicated protocol for ubiquitylation assay in mammalian cells is described to assist scientists in addressing ubiquitylation of specific substrates and E3 ubiquitin ligases.

We provide a detailed protocol for a ubiquitylation assay of a specific substrate and an E3 ubiquitin-ligase in mammalian cells. HEK293T cell lines were used for protein overexpression, the polyubiquitylated substrate was purified from cell lysates by immunoprecipitation, and resolved in SDS-PAGE. Immunoblotting was used to visualize this post-translational modification.

Memeli Hücre Lisatlarında E3 Ubikitin-ligaz ile Substrat Ubikitilasyonunun Değerlendirilmesi

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Nörogelişimsel Bozukluklarda DUB Varyantlarının Bölünme Testi Kullanılarak Değerlendirilmesi

Measuring Enzymatic Activity of Neurodevelopmental Disorder-Associated Deubiquitylating Enzymes via an In Vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. Discrete disorders caused by single genes provide models to investigate mechanisms driving atypical neurodevelopment. Variants of genes encoding deubiquitylating enzyme (DUB) family proteins are associated with several NDDs, but there is a need to determine the pathogenic mechanisms of disorders driven by these gene variants. The impact of gene variants on DUB activity can be experimentally determined using a substrate-independent in vitro ubiquitin cleavage assay. This assay does not require knowledge of downstream substrates to directly measure catalytic activity. Here, the protocol for determining the impact of gene variants on enzymatic activity is modeled using the DUB Ubiquitin Specific Protease 27, X-linked (USP27X), which is mutated in X-linked intellectual disability 105 (XLID105). This experimental pipeline can be used to clarify the mechanisms underlying neurodevelopmental disorders driven by variants in DUB genes.

<meta charset="utf8"></head><body>Nörogelişimsel Bozuklukla İlişkili Deubikitile Edici Enzimlerin İn Vitro Ubikitin Zincir Bölünme Testi ile Enzimatik Aktivitesinin Ölçülmesi

This protocol explains how to measure the effect of genetic variation associated with neurodevelopmental disorders on deubiquitylating enzyme activity by combining recombinant protein purification with ubiquitin chain cleavage assays.

Nörogelişimsel Bozuklukla İlişkili Deubikitile Edici Enzimlerin İn Vitro Ubikitin Zincir Bölünme Testi ile Enzimatik Aktivitesinin Ölçülmesi

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. ...

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases in ubiquitin-proteasome activity are critical for synaptic plasticity and memory formation and aberrant changes in this system are associated with a variety of neurological, neurodegenerative and psychiatric disorders. One of the issues in studying ubiquitin-proteasome functioning in the brain is that it is present in all cellular compartments, in which the protein targets, functional role and mechanisms of regulation can vary widely. As a result, the ability to directly compare brain ubiquitin protein targeting and proteasome catalytic activity in different subcellular compartments within the same animal is critical for fully understanding how the UPS contributes to synaptic plasticity, memory and disease. The method described here allows collection of nuclear, cytoplasmic and crude synaptic fractions from the same rodent (rat) brain, followed by simultaneous quantification of proteasome catalytic activity (indirectly, providing activity of the proteasome core only) and linkage-specific ubiquitin protein tagging. Thus, the method can be used to directly compare subcellular changes in ubiquitin-proteasome activity in different brain regions in the same animal during synaptic plasticity, memory formation and different disease states. This method can also be used to assess the subcellular distribution and function of other proteins within the same animal.

This protocol is designed to efficiently quantify ubiquitin-proteasome system (UPS) activity in different cellular compartments of the rodent brain. Users are able to examine UPS functioning in nuclear, cytoplasmic and synaptic fractions in the same animal, reducing the amount of time and number of animals needed to perform these complex analyses.

Subcellular Ubiquitin ölçümü-kemirgen beyinde proteasom aktivitesi

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...

Nörobilim

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, techniques for studying the regulatory mechanism of this system are essential to elucidating the cellular and molecular processes of the aforementioned diseases. The use of hemagglutinin derived ubiquitin probes outlined in this paper serves as a valuable tool for the study of this system. This paper details a method that enables the user to perform assays that give a direct visualization of deubiquitinating enzyme activity. Deubiquitinating enzymes control proteasomal degradation and share functional homology at their active sites, which allows the user to investigate the activity of multiple enzymes in one assay. Lysates are obtained through gentle mechanical cell disruption and incubated with active site directed probes. Functional enzymes are tagged with the probes while inactive enzymes remain unbound. By running this assay, the user obtains information on both the activity and potential expression of multiple deubiquitinating enzymes in a fast and easy manner. The current method is significantly more efficient than using individual antibodies for the predicted one hundred deubiquitinating enzymes in the human cell.

The current protocol details a method for measuring the activity of functionally homologous deubiquitinating enzymes. Specialized probes covalently modify the enzyme and allow for detection. This method holds the potential to identify new therapeutic targets.

Hücre Kuşakları ve Doku Örneklerinde Deubiquitinating Enzim aktivitesinin ölçülmesi için bir yöntem

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Paralel Reaksiyon İzleme ile Ubiquitin Zincir Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Bir endojen translasyonel modifikasyon profil hedef proteinler için tanımlamak için bir kapsamlı Immunoprecipitation zenginleştirme sistemi kullanan

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

Ubiquitin ve Ubiquitin benzeri Bağımlı Post-translational Modifikasyonlar ve Önemli Değişikliklerin Belirlenmesi Profilleme

Protein Ubikitinasyon Tespiti

Memeli Hücre Lisatlarında E3 Ubikitin-ligaz ile Substrat Ubikitilasyonunun Değerlendirilmesi

Nörogelişimsel Bozuklukla İlişkili Deubikitile Edici Enzimlerin İn Vitro Ubikitin Zincir Bölünme Testi ile Enzimatik Aktivitesinin Ölçülmesi

Nörogelişimsel Bozuklukla İlişkili Deubikitile Edici Enzimlerin İn Vitro Ubikitin Zincir Bölünme Testi ile Enzimatik Aktivitesinin Ölçülmesi

Nörogelişimsel Bozuklukla İlişkili Deubikitile Edici Enzimlerin İn Vitro Ubikitin Zincir Bölünme Testi ile Enzimatik Aktivitesinin Ölçülmesi

Subcellular Ubiquitin ölçümü-kemirgen beyinde proteasom aktivitesi

Hücre Kuşakları ve Doku Örneklerinde Deubiquitinating Enzim aktivitesinin ölçülmesi için bir yöntem