저자는 대표 결과에 설명된 대로 MG-132의 처리를 가진 세포 펠릿의 창조에 있는 그녀의 도움에 대한 셀린 지티를 감사하고 싶습니다 및 프로토콜에 사용된 E. coli 펠릿의 그녀의 제공을 위한 Elise Mommaerts.

1. 무거운 펩타이드 표준의 준비
<ol><li>공급 업체및 구입 한 무거운 펩 티드의 품질에 따라, 무거운 펩 티드 희석 될 필요가 있을 것 이다. 이 프로토콜은 표 1에서보고된 펩티드 서열을 사용했으며, C-말단 아미노산은 리신(13 C615N2-lysine)또는 아르기닌(13 C615N4-아르기닌)으로변형되었다.<ol>
<li>무거운 펩티드를 혼합하여 50% 아세토닐릴(ACN)으로 혼합하여 10μM에서 각 펩타이드와 펩타이드 믹스를 만듭니다.</li>
		<li>펩티드 믹스의 알리쿼트를 만들고 -80°C에 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 샘플 준비
<ol><li>샘플 리시스 참고: 유비퀴틴 체인의 안정성은 시료 준비 중에 고려해야 합니다. 생물학적 샘플과 버퍼를 4°C에서 냉각시키고 가능한 한 빨리 유비퀴틴 안정화 버퍼에 샘플을 추가합니다.<ol>
<li>1M NH4HCO3(중탄산암암염) 용액을 물에 준비하고 1M NaOH를 사용하여 pH를 8로 조정한다.</li>
		<li>물에 200mM N-ethylmaleimide (NEM)의 솔루션을 준비합니다.</li>
		<li>50mM NH4HCO 3/10m NEM에서 8M 우레아를 이용한 유비퀴틴 안정화 버퍼를 준비하십시오. 참고: 8M 우레아의 5mL 용액은 우레아가 있는 포화 용액에서 물의 팽창을 감안할 때 5mL 미만의 물이 상당히 필요합니다. 주의: 고온에서 폴리우레아를 형성하는 우레아의 경향으로 인해 50°C 이상의 버퍼를 준비하지 마십시오.</li>
		<li>단백질의 0.5 μg/μL을 목표로 하는 유비퀴틴 안정화 완충제에서 조사되는 생물학적 샘플을 재중단하고 시료에 적합한 방법으로 세포를 용인한다. SFX 150 브랜슨 소니피어가 70% 강도로 설정된 3개의 10s 펄스로 구성된 초음파 처리 방법은 각 펄스 사이의 얼음에 10초의 브레이크를 사용하여, 이 프로토콜의 세포주에 사용되었다.</li>
		<li>원심분리기 샘플은 탁상 원심분리기에서 4°C에서 10분 동안 18,000 x g에서 샘플링합니다.</li>
		<li>상신단백질을 신선한 저단백질 결합 마이크로센심분리기 튜브로 전달합니다. 필요한 경우 이 시점에서 샘플을 -20°C로 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>샘플 및 제어 준비
	<ol>
<li>시료가 동결되면, 우레아를 빠르게 용해하기 위해 해동하는 동안(예: 열믹서와)를 혼합합니다. 주의: 고온에서 폴리우레아를 형성하는 우레아의 경향으로 인해 50°C 이상의 온도를 사용하지 마십시오.</li>
		<li>원심분리기 샘플은 탁상 원심분리기에서 4°C에서 10분 동안 18,000 x g에서 샘플링합니다.</li>
		<li>20 μg의 시료를 신선한 저결합 마이크로센심분리기 튜브로 옮기고 유비퀴틴 안정화 버퍼로 부피를 50 μL로 조정합니다.</li>
		<li>유비퀴틴 안정화 버퍼(50 μL)의 정규화된 부피를 사용하여 음수 컨트롤을 만듭니다. 이 샘플에서는 각 펩타이드의 가벼운 버전이 없어야 하므로 스파이크인 무거운 펩타이드에서 발생하는 빛 오염을 관찰할 수 있습니다. 이러한 음수 제어는 섹션 3.1에 설명된 PRM의 보존 시간 스케줄링에도 사용되었습니다.</li>
		<li>유비퀴틴 안정화 버퍼와 유비퀴틴 안정화 버퍼(50 μL)의 정규화된 부피에 상용 체인 유형을 추가하여 양수 제어를 만들었습니다. 일반적으로 K63, K48 및 M1을 사용할 수 있습니다. 대표적인 결과 K48, K63, M1의 20ng가 활용되었다.</li>
	</ol></li>
	<li>감소, 알킬레이션 및 소화
	<ol>
<li>물에 50mM 암모늄 중탄산염(NH4HCO3)의용액을 준비하고 1M NaOH로 pH = 8로 샘플을 조정한다.</li>
		<li>LB 국물에서 자란 대장균의 배양은 5분 동안 5,000 x g의 원심분리되어 펠릿을 형성했으며, 그 후 PBS로 2배 세척한 후 유비퀴틴 안정화 버퍼에서 5μg/μL로 재서스펜션을 했다.</li>
		<li>각 샘플 및 제어에 대장균 리세이트 1 μg를 추가합니다. 이 프로토콜은 대장균(DH10B)을 사용하지만 유비퀴틴이 없는 복잡한 용해재를 사용할 수 있습니다. 유비퀴틴은 모든 진핵생물에게 일반적입니다. 참고: 대장균 용해 매트릭스를 사용하면 플라스틱 제품에 대한 비특이적 접착으로 인한 펩티드의 손실이 줄어듭니다. 이는 단백질 함량이 제한된 음수 조절 또는 샘플에서 특히 두드러지며 K6312의관측에 강한 영향을 미친다.</li>
		<li>MS 급수에서 500mM 트리스(2-carboxyethyl)의 포스핀(TCEP)의 용액을 준비한다(DTT는 대안으로 사용될 수 있음).</li>
		<li>TCEP를 최종 농도 50mM에 추가하여 샘플 및 컨트롤을 줄입니다. 소용돌이는 실온 (RT)에서 30 분 동안 배양하기 전에 잠시 배양합니다. DTT를 사용하는 경우 온도는 50 °C로 상승해야합니다. 주의: 고온에서 폴리우레아를 형성하는 우레아의 경향으로 인해 50°C 이상의 온도를 사용하지 마십시오.</li>
		<li>NH4HCO3에서550mM 클로로아세타미드(CAA)의 용액을 준비한다. 어둠 속에서 보관하십시오.</li>
		<li>55mMM의 최종 농도에 CAA를 추가하여 샘플 및 컨트롤을 알킬레이트합니다. 소용돌이는 어둠 속에서 RT에서 20 분 동안 배양하기 전에 잠시 배양했습니다. 참고: CAA는 -GG 수정(114.0429)13으로오인되는 리신 잔류물에서 이중 카르바미도메틸 수정(114.0429)의 가능성을 감소시키는 환원제로 요오도아세타미드 대신 사용된다.</li>
		<li>단백질 함량에 대한 1:25 (w/w) 비율로 샘플에 내분펩티다아제 LysC를 추가합니다. 37°C에서 3시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>50mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v)의 200 μL로 샘플 및 컨트롤을 희석시 희석시.</li>
		<li>단백질 함량에 대한 비율1:25에서 샘플에 트립신을 추가합니다. 37°C에서 12시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>각 시료및 대조군 시료에 1:10 비율 v/v로 MS 등급 물에 10% 포름산(FA) 용액을 추가합니다. C18 정리 전에 pH가 & 3) 있는지 확인하고 필요한 경우 포믹산을 더 추가하십시오.</li>
		<li>각 샘플 및 제어에 섹션 1에서 생성된 무거운 펩타이드 표준의 0.5 μL을 추가합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>펩타이드 정리
	<ol>
<li>몇몇 제조업체는 C18 정리 팁 또는 플레이트를 제공합니다. 사용 된 제품에 대한 제조업체의 지침을 따르고, 진공 원심 분리기에서 건조 에로티드 펩티드를 따르십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>3. LC-MS/MS에 의한 분석
<ol><li>예정되지 않은 방식으로 무거운 펩타이드 표준에 대한 초기 PRM 분석을 실행합니다.<ol>
<li>말린 시료를 MS 로딩 버퍼 2% ACN/0.05% 트리플루오로아세산(TFA)의 10μL로 재연한다.</li>
		<li>HPLC에 역상 C18 분석 컬럼(75 μm x 15cm, 2 μm 100 Å C18 구슬)을 장착하여 나노플로우 MS를 위해 설계되었습니다. 분석 컬럼의 수명을 보존하기 위해 희생 트랩 컬럼(75 μm x 2cm, 3 μm, 100 Å C18 구슬)이 여기에 사용되었지만 필요하지 는 않다.</li>
		<li>고해상도 질량 분광계에 있는 나노 ESI 소스에 분석 컬럼의 출력을 결합합니다.</li>
		<li>질량 분광계에 적합한 표적 프로테오믹스 방법을 활용한다. 예를 들어 Q-Exactive 플러스 2실험 방법에서 Full MS와 PRM 실험 간에 순환합니다. Full MS 실험의 경우 최대 IT로 AGC 목표 1e6 및 240ms를 사용한 120,000개의 해상도가 사용되었습니다. PRM 실험의 경우 동일한 AGC 목표와 최대 IT가 60,000의 낮은 해상도와 1.2 m/z의 격리 창으로 사용되었습니다.</li>
		<li>HPLC 자동 샘플러를 사용하여 음수 제어의 200 ng를 분석 열에 삽입합니다. 분석 컬럼의 샘플에 선형 그라데이션을 적용하여 ACN 농도를 ~45분 동안 2~25%에서 증가시합니다. 참고: 25% ACN 농도는 일반적인 유비퀴틴 토폴로지 특성 펩타이드의 낮은 친성 특성으로 인해 프로테오믹스에 대해 평소보다 낮습니다. 다른 펩티드가 정량화될 경우, 더 높은 ACN 농도가 양호한 표적 분리를 달성하기를 원할 수 있다.</li>
		<li>섹션 4.2에 설명된 대로 일정 실행 결과를 분석하여 예약된 포함 목록을 만듭니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플 분석<ol>
<li>섹션 4.2에서 작성된 예약된 포함 목록의 사용과 별도로 3.1에서 일정에 대해 설명된 나머지 샘플을 실행합니다. 참고: 후속 샘플에서 이전 실행에서 이월이 감지되지 않도록 양수 제어 후 공백을 실행해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 소프트웨어 분석
<ol><li>활용된 MS에 적합한 서식 포함 목록을 만듭니다. 이 프로토콜은 잘 문서화 된 지원과 도움을 제공하는 오픈 소스 소프트웨어 스카이 라인 (버전 19.1.0.193)(https://skyline.ms)을 사용했다. 내보내기 격리 목록 기능을 사용하여 여러 질량 분광기에 대해 포함 목록을 만들 수 있습니다.<ol>
<li>새 스카이라인 문서를 엽니다.</li>
		<li>무거운 토폴로지 특성 펩티드에 적합한 무거운 동위원소 변형을 선택합니다. 설정에서| 수정 탭 에서 펩티드 설정, 잠재적인 수정을 보려면 이름 필드를 클릭합니다. 선택은 구입 한 무거운 펩티드의 동위원소 상태를 기반으로합니다. 이 예에서, 중류리신(13C615N 2-lysine) 또는 C-종산시 중형아르기닌(13C615N4-아르기닌)을운반하는 합성 펩티드가 사용되었다. 적절한 레이블은 "라벨:13C(6)15N(2) (C-term K)" 및 "라벨:13C(6)15N(4) (C-term R)"입니다.</li>
		<li>설정을 선택합니다| 전환. 필터 탭에는 전구체 요금 2, 3, 4가포함됩니다.</li>
		<li>편집을 선택하여 펩티드를 삽입합니다| 삽입| 펩타이드.</li>
		<li>토폴로지 특성 펩티드 서열 및 단백질 이름(예: "Chain-K63")을 포함한 관련 분야를 채우는 다.</li>
		<li>이제 대상 패널에 표시된 각 펩티드를 확장합니다. 원치 않는 충전 상태를 삭제합니다. 사용되는 질량 분광계에 따라 다를 수 있는 바람직한 전하 상태 및 충돌 에너지는 각 토폴로지 특성 펩타이드에 대해 표 1에도시된다.</li>
		<li>각 토폴로지 특성 펩티드(GG가 서열에 포함된 M1 제외)에 대해 시퀀스를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 수정을 선택합니다. 이름 필드를 클릭하고 모든것을 표시하여구조 수정으로 GG를 추가 ... > 선택하기 전에 "글리글리 (K)".</li>
		<li>격리 목록 파일 내보내기| 수출| 격리 목록,계측기 유형을 선택하고 메서드 유형을 표준으로 설정합니다. 확인을 선택하면 PRM 메서드를 만드는 데 사용할 수 있는 *.csv 파일을 저장하는 프롬프트가 열립니다.</li>
	</ol></li>
	<li>오픈 소스 스카이라인 소프트웨어를 사용하여 여기에 설명된 무거운 펩타이드 스케줄링 실행에 따라 예약된 포함 목록을 만듭니다.<ol>
<li>섹션 4.1에 설명된 대로 대상 목록을 만듭니다.</li>
		<li>파일을 선택하여 예약 실행을 3.1로 가져옵니다| 가져오기| 결과.</li>
		<li>신분증을 검토합니다. 각 펩티드에 대한 무거운 신호는 각 무거운 펩티드 항목에 대한 질량을 클릭하여 관찰할 수 있습니다. 피크의 올바른 인식은 종종 자동으로 결정되지만 x 축 아래에서 클릭 및 드래그를 사용하여 피크를 선택하여 소프트웨어에 수동 큐레이션이 필요할 수 있습니다.</li>
		<li>무거운 변형에 대해 선택된 보존 시간도 라이트 버전에 적용되므로 PRM에 대한 일정이 생성됩니다. 설정에서 일정 창을 수정할 수 있습니다| 시간 창을변경하여 예측 탭을 사용하여 펩타이드 설정.</li>
		<li>이제 File을 사용하여 예약된 포함 목록을 내보낼 수 있습니다| 수출| 격리 목록 및 예약된 대로 적절한 계측기 유형 및 설정 방법 유형을 선택합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>데이터를 분석합니다.<ol>
<li>섹션 4.2에서 일정 실행 분석과 동일한 방식으로 샘플을 가져옵니다.</li>
		<li>모든 샘플을 완전히 가져온 후에는 전환큐레이션을 하는 것이 좋습니다. 간섭또는 신호 대 잡음 비율이 불량하여 전환되는 프로세스입니다. 큐레이션 전후의 크로마토그램의 예가 도 4에도시된다.</li>
		<li>이제 관련 그래프를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 복사 데이터를 선택하거나 파일을 선택하여 데이터를 내보낼 수 있습니다| 수출| 결과.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

프로테오메 내의 유비퀴틴 상태의 분석은 다양한 생물학적 질문에 대한 중요성을 증가시고 있다. 샘플의 유비쿼터티션 상태에 대한 설명은 단백질의 프로파일뿐만 아니라 이러한 유비쿼터티화의 토폴로지에도 초점을 맞추어야 합니다. 여기에 설명된 바와 같이 표적 MS에 의한 이 토폴로지의 평가는, 생물학 조사의 넓은 범위에 있는 역할이 있습니다.
여기에 설명된 프로토콜...

단백질 기능 과 안정성의 가까운 조절은 가장 중요 한 중요 한, 그들은 생물학의 phenotypic 제어의 주요 드라이버로. 단백질의 기능은 두 가지 구성 요소로 구성됩니다: 본질적인 폴리펩티드 서열 및 번역 후 변형(PTM). 글리코실화, 인산화, 아세틸화 및 메틸화1을포함한 다양한 화학적 PTM이 확인되었다. 1975년, Goldstein외. 2는 작은 단백질을 확인하고 유비쿼터스 특성으로 인해 유비퀴틴이라고 명명했습니다. 유비퀴틴은 단백질 분해3에서중요한 것으로 나타났다. 그러나, 그 이후로 신호 분자로서의 유비퀴틴의 기능이 단백질 안정성조절을 훨씬 뛰어넘는 것으로 확립되었다. 유비퀴틴 시그널링은 단백질 안정화, 자가식, 세포 주기 제어 및 단백질 인신 매매4와같은 광범위한 다른 생물학적 기능에 관여한다.
다른 PtM은 일반적으로 이진 (즉, 단백질은 변형되거나 수정되지 않은 상태로 방치됨)이지만, 유비퀴틴은 단량제 또는 폴리머 체인으로 단백질을 수정할 수 있으며, 부착된 유비퀴틴 자체가 유비퀴티드화된다. 또한, 이러한 폴리비비퀴티닝 체인은 8개의 연계부위5,6중 하나에 부착된 이전 유비퀴틴의 유비퀴티닝을 통해 여러 토폴로지에서 개발할 수 있다. 유비퀴틴은 유비퀴틴의 C-terminus가 7개의 리신 잔기(K06, K11, K27, K29, K33, K48, K48, K63) 또는 이전 유비퀴틴(Mquitin, U63)의 N-터미널(Mquitin) 또는 이전 유비퀴틴(Mquitin) 또는 N-터미널(Mquitin)에 의해 전달된다. 이 사슬 토폴로지는 수정 하에 단백질의 운명에 열쇠입니다. 예를 들어, K48 또는 K11 연결 체인을 사용하여 수정하면 프로테솜에서 변형된 단백질의 분해를 초래하며, NF-kB 시그널링의 활성화를 위해 선형 체인이 필요하다. 따라서, 이러한 사슬 토폴로지의 상대적 분포는 다양한 생물학적 질문과 관련이 있다.
질량 분광법(MS)의 사용은 항체 기반 또는 친화성 기반 상호 작용7,8에의존하지 않기 때문에 유비퀴틴 사슬 토폴로지 분석에 특히 유익하며, 그 중 상당수는 특이성이 제한되어 있으며 다양한 사슬 유형 사이에서 분화하지 않는다. 다른 검출 가능성은 유전자 변형 유비퀴틴 돌연변이를 사용하고 있습니다. 여기서, 특정 리신은 유비퀴틴에 의한 수정을 지원할 수 없는 아르기닌으로 교환된다. 기판 단백질에 유비퀴틴 사슬 형성의 부족은 다음 특정 토폴로지9에대한 증거로 해석된다.
유비퀴티드 단백질의 MS 기반 식별은 유비퀴틴의 C-종물이 MS 분석을 위한 시료의 프로테오리틱 준비 중에 트립신에 의해 인식되는 위치(74)에 아르기닌 잔류물을 함유하고 있으며, C-말단 이중 글리신을 분리한다는 사실에 근거한다. 이 글리글리(-GG)는 기판 단백질의 리신 잔류물의 ε 아미노 그룹에 부착된 채로 남아 있다. 유비퀴틴 토폴로지 분석을 위해, 유비퀴틴의 7개의 리신 잔류물 중 하나에서 수정이 발생합니다. 이것은 GG에 의해 변형되는 리신 잔류물을 운반하는 7개의 키 펩티드 세트를 생성하며, 각 토폴로지(그림2)에특이적으로 변형된다. 예를 들어, K06 토폴로지를 사용하면 아미노산 서열의 위치 6의 리신은 이 리신에 첨가된 114Da의 -GG 변형으로 트립틱 소화로부터 보호됩니다.
MS에 의한 특정 소정의 펩타이드의 식별은 표적 프로테오믹스, 또는 보다 구체적으로, 표적 펩티드획득(10)이라고한다. 사용되는 질량 분광계의 성능에 따라 두 가지 방법이 개발되었습니다. 이들은 선택된 반응 모니터링(SRM), 또한 다중 반응 모니터링(MRM) 및 병렬 반응 모니터링(PRM)이다. SRM은 전구체 m/z 및 제품 이온 m/z로 구성된 전환 선택을 포함합니다. 반대로 PRM은 전구체 m/z만 필요합니다. 포스트 선택, 제품 이온의 전체 측량 스캔이 수행됩니다. 이는측정(11)에앞서 특정 질량 분광계에 대한 수량에 적합한 제품 이온을 선택하지 않는다는 장점이 있다. SRM과 PRM 은 기기에 따라 예약할 수 있습니다. 스케줄링은 펩타이드가 크로마토그래피 시스템에서 정의된 보존 시간에 용례하기 때문에 분석에 특정 이온이 포함되는 시간 창을 할당하는 관행이다. 지정된 시간에 심문되는 이온 수를 줄이면 해당 이온의 심문 빈도가 증가하여 데이터 정확도를 향상시킵니다.
일반적으로, 유비퀴틴 토폴로지대상표적프로테오믹스의 적용은 다른 표적 프로테오믹스 실험과 동일하다. 그러나 두 가지 주요 차이점이 중요합니다: 첫째, 유비퀴틴 체인의 안정성을 고려해야 합니다. 세포 리시스시 사슬을 빠르게 저하시키는 여러 가지 강력한 비쿼터팅 효소(DUBs)가 있습니다. 유비퀴틴 특이적 프로테아제는 티오에스테르아제와 메탈로로테아제의 두 가지 범주로 나뉩니다. 유비퀴틴 하이드로라제의 대부분은 티오스테라아제이며 활성 센터에서 시스테인 잔류물을 운반합니다. 이 시스테인 잔류물을 알킬 수 에 의해, 그들은 비활성화 될 수 있습니다. 이와 같이, N-ethylmaleimide (NEM)와 같은 알킬라팅 에이전트를 포함하는 유비퀴틴 안정화 버퍼의 사용, 고도로 데스팅 화학 물질, 냉각 샘플을 유지하는 것은 성공적인 분석에 필수적이다. 둘째, 다른 표적 실험과 달리 펩타이드 선택은 고정된다. 일반적인 표적 실험에서, 좋은 크로마토그래피 및 이온화 성능을 위해 프로테오티픽 펩티드를 선택할 수 있다. K48과 같은 일부 토폴로지 특성 펩티드의 경우 이러한 특성은 좋으며 다른 제품은 덜 바람직합니다. 예를 들어, 전형적인 역상 설정에서 K33 크로마토그래피는 확장된 용출 프로파일의 형성으로 인해 불량하며, K27 펩티드의 열악한 이온화 특성으로 인해 MS12에의한 가시성을 감소시킵니다.
이 프로토콜에서, 우리는 PRM에 의하여 생물학 견본의 유비퀴틴 토폴로지 평가를 능력을 발휘하는 방법을 기술합니다. 절차에 대한 예 데이터는 여러 상이한 세포 유형에서 MG-132 억제제 치료를 사용하여 프로테좀의 교란을 사용하여 제시된다.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrile (ACN)</td><td>Merck</td><td>100029</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate (ABC)</td><td>Fluka</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 16</td><td></td></tr><tr><td>Chloroacetamide (CAA)</td><td>Sigma</td><td>22790</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid (FA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85178</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Peptides</td><td>JPT Peptide Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Dionex</td><td>Ulitimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>LC Column</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>160321</td><td></td></tr><tr><td>Lys C</td><td>Wako</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>Mass Spectrometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q-Exactive Plus</td><td></td></tr><tr><td>N-ethylmaleimide (NEM)</td><td>ACROS Organics</td><td>156100050</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Chain K48</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-240</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Chain K63</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-340-100</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Chain M1</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-710B-025</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier</td><td>Branson sonifier</td><td>SFX 150</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer Comfort</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td><td>Sigam</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>77720</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>V1511A</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>Waters &amp;mu;Elution C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt; plates</td><td>Waters</td><td>186002318</td><td></td></tr></tbody></table>

ubiquitin chain analysis by parallel reaction monitoring

프로테오메 내의 유비퀴틴 사슬 토폴로지의 글로벌 프로필에 대한 평가는 광범위한 생물학적 질문에 답하는 데 관심이 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 사슬에 통합된 유비퀴틴의 트립틱 소화 후 남은 디 글리신(-GG) 수정을 활용합니다. 이러한 토폴로지 특성 펩티드를 정량화함으로써 각 유비퀴틴 사슬 토폴로지의 상대적 풍부를 결정할 수 있다. 병렬 반응 모니터링 실험에 의해 이러한 펩티드를 정량화하는 데 필요한 단계는 유비퀴틴 사슬의 안정화를 고려하여 보고된다. 무거운 컨트롤, 세포 리시스 및 소화의 준비는 적절한 질량 분광계 설정 및 데이터 분석 워크플로우와 함께 설명됩니다. 유비퀴틴 토폴로지에 대한 혼란을 가진 예제 데이터 세트가 제공되며 프로토콜의 최적화가 결과에 미치는 영향에 대한 예제가 함께 제공됩니다. 설명된 단계를 수행함으로써 사용자는 생물학적 맥락에서 유비퀴틴 토폴로지 환경에 대한 글로벌 평가를 수행할 수 있습니다.

PRM에 의한 유비퀴틴 사슬 분석의 사용을 입증하기 위해 마우스 흑색종 세포주 B16, 및 2개의 일반적인 인간 세포주 A549(아데노카르시노믹 폐포기 기저 상피세포) 및 HeLa(자궁 경부암세포)를 3개의 세포주를 선택하였다. 이러한 배양은 수확 하기 전에 4 시간 동안 0, 10, 또는 100 mM MG-132로 처리되기 전에 적절한 매체에서 중간 기하 단계로 성장했다. MG-132는프로테좀(14)에의한 유비퀴틴...

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Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

이 방법은 유비퀴틴 체인 토폴로지의 글로벌 변화에 대한 평가를 설명합니다. 평가는 질량 분광계 기지를 둔 표적 proteomics 접근의 응용에 의해 수행됩니다.

병렬 반응 모니터링에 의한 유비퀴틴 연쇄 분석

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

ubiquitin-chain-analysis-by-parallel-reaction-monitoring

Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.5K 조회수.  Luxembourg Institute of Health. 이 방법은 유비퀴틴 체인 토폴로지의 글로벌 변화에 대한 평가를 설명합니다. 평가는 질량 분광계 기지를 둔 표적 proteomics 접근의 응용에 의해 수행됩니다.

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Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which may be essential for a given protein&#39;s role both physiologically and pathologically. Enrichment of PTMs is often necessary when investigating the PTM status of a target protein, because PTMs are often transient and relatively low in abundance. Many pitfalls are encountered when enriching for a PTM of a target protein, such as buffer incompatibility, the target protein antibody is not IP-compatible, loss of PTM signal, and others. The degree of difficulty is magnified when investigating multiple PTMs like acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, and tyrosine phosphorylation for a given target protein. Studying a combination of these PTMs may be necessary, as crosstalk between PTMs is prevalent and critical for protein regulation. Often, these PTMs are studied in different lysis buffers and with unique inhibitor compositions. To simplify the process, a unique denaturing lysis system was developed that effectively isolates and preserves these four PTMs; thus, enabling investigation of potential crosstalk in a single lysis system. A unique filter system was engineered to remove contaminating genomic DNA from the lysate, which is a problematic by-product of denaturing buffers. Robust affinity matrices targeting each of the four PTMs were developed in concert with the buffer system to maximize the enrichment and detection of the endogenous states of these four PTMs. This comprehensive PTM detection toolset streamlines the process of obtaining critical information about whether a protein is modified by one or more of these PTMs.

Investigating multiple, endogenous post-translational modifications for a target protein can be extremely challenging. Techniques described here utilize an optimized lysis buffer and filter system developed with specific PTM-targeting, affinity matrices to detect the acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, and tyrosine phosphorylation modifications for a target protein using a single, streamlined system.

대상 단백질에 대 한 내 생 포스트 번역 상 수정 프로필을 식별 하는 포괄적인 Immunoprecipitation 농축 시스템을 활용 하 여

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

연구

생화학

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

단백질 Ubiquitination의 감지

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

생물학

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, including cell survival, proliferation, and differentiation. It is a reversible process that consists of a covalent attachment of ubiquitin to the substrate through a cascade reaction of at least three different enzymes, composed of E1 (Ubiquitin-activation enzyme), E2 (Ubiquitin-conjugating enzyme), and E3 (Ubiquitin-ligase enzyme). The E3 complex plays an important role in substrate recognition and ubiquitylation. Here, a protocol is described to evaluate substrate ubiquitylation in mammalian cells using transient co-transfection of a plasmid encoding the selected substrate, an E3 ubiquitin ligase, and a tagged ubiquitin. Before lysis, the transfected cells are treated with the proteasome inhibitor MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) to avoid substrate proteasomal degradation. Furthermore, the cell extract is submitted to small-scale immunoprecipitation (IP) to purify the polyubiquitylated substrate for subsequent detection by western blotting (WB) using specific antibodies for ubiquitin tag. Hence, a consistent and uncomplicated protocol for ubiquitylation assay in mammalian cells is described to assist scientists in addressing ubiquitylation of specific substrates and E3 ubiquitin ligases.

We provide a detailed protocol for a ubiquitylation assay of a specific substrate and an E3 ubiquitin-ligase in mammalian cells. HEK293T cell lines were used for protein overexpression, the polyubiquitylated substrate was purified from cell lysates by immunoprecipitation, and resolved in SDS-PAGE. Immunoblotting was used to visualize this post-translational modification.

포유동물 세포 용해물에서 E3 유비퀴틴-리가아제에 의한 기질 유비퀴틸화의 평가

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Cleavage Assay를 사용한 신경 발달 장애의 DUB 변이체 평가

Measuring Enzymatic Activity of Neurodevelopmental Disorder-Associated Deubiquitylating Enzymes via an In Vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. Discrete disorders caused by single genes provide models to investigate mechanisms driving atypical neurodevelopment. Variants of genes encoding deubiquitylating enzyme (DUB) family proteins are associated with several NDDs, but there is a need to determine the pathogenic mechanisms of disorders driven by these gene variants. The impact of gene variants on DUB activity can be experimentally determined using a substrate-independent in vitro ubiquitin cleavage assay. This assay does not require knowledge of downstream substrates to directly measure catalytic activity. Here, the protocol for determining the impact of gene variants on enzymatic activity is modeled using the DUB Ubiquitin Specific Protease 27, X-linked (USP27X), which is mutated in X-linked intellectual disability 105 (XLID105). This experimental pipeline can be used to clarify the mechanisms underlying neurodevelopmental disorders driven by variants in DUB genes.

<meta charset="utf8"></head><body>In vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay를 통한 신경 발달 장애 관련 Deubiquitylating Enzymes의 효소 활성 측정

This protocol explains how to measure the effect of genetic variation associated with neurodevelopmental disorders on deubiquitylating enzyme activity by combining recombinant protein purification with ubiquitin chain cleavage assays.

In vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay를 통한 신경 발달 장애 관련 Deubiquitylating Enzymes의 효소 활성 측정

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. ...

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases in ubiquitin-proteasome activity are critical for synaptic plasticity and memory formation and aberrant changes in this system are associated with a variety of neurological, neurodegenerative and psychiatric disorders. One of the issues in studying ubiquitin-proteasome functioning in the brain is that it is present in all cellular compartments, in which the protein targets, functional role and mechanisms of regulation can vary widely. As a result, the ability to directly compare brain ubiquitin protein targeting and proteasome catalytic activity in different subcellular compartments within the same animal is critical for fully understanding how the UPS contributes to synaptic plasticity, memory and disease. The method described here allows collection of nuclear, cytoplasmic and crude synaptic fractions from the same rodent (rat) brain, followed by simultaneous quantification of proteasome catalytic activity (indirectly, providing activity of the proteasome core only) and linkage-specific ubiquitin protein tagging. Thus, the method can be used to directly compare subcellular changes in ubiquitin-proteasome activity in different brain regions in the same animal during synaptic plasticity, memory formation and different disease states. This method can also be used to assess the subcellular distribution and function of other proteins within the same animal.

This protocol is designed to efficiently quantify ubiquitin-proteasome system (UPS) activity in different cellular compartments of the rodent brain. Users are able to examine UPS functioning in nuclear, cytoplasmic and synaptic fractions in the same animal, reducing the amount of time and number of animals needed to perform these complex analyses.

설치류 뇌의 세포외 유비퀴틴-프로테아솜 활동 정량화

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...

신경과학

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, techniques for studying the regulatory mechanism of this system are essential to elucidating the cellular and molecular processes of the aforementioned diseases. The use of hemagglutinin derived ubiquitin probes outlined in this paper serves as a valuable tool for the study of this system. This paper details a method that enables the user to perform assays that give a direct visualization of deubiquitinating enzyme activity. Deubiquitinating enzymes control proteasomal degradation and share functional homology at their active sites, which allows the user to investigate the activity of multiple enzymes in one assay. Lysates are obtained through gentle mechanical cell disruption and incubated with active site directed probes. Functional enzymes are tagged with the probes while inactive enzymes remain unbound. By running this assay, the user obtains information on both the activity and potential expression of multiple deubiquitinating enzymes in a fast and easy manner. The current method is significantly more efficient than using individual antibodies for the predicted one hundred deubiquitinating enzymes in the human cell.

The current protocol details a method for measuring the activity of functionally homologous deubiquitinating enzymes. Specialized probes covalently modify the enzyme and allow for detection. This method holds the potential to identify new therapeutic targets.

세포주 및 조직 샘플에서 Deubiquitinating 효소의 활성을 측정 방법

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

병렬 반응 모니터링에 의한 유비퀴틴 연쇄 분석

요약

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대상 단백질에 대 한 내 생 포스트 번역 상 수정 프로필을 식별 하는 포괄적인 Immunoprecipitation 농축 시스템을 활용 하 여

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

단백질 Ubiquitination의 감지

포유동물 세포 용해물에서 E3 유비퀴틴-리가아제에 의한 기질 유비퀴틸화의 평가

In vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay를 통한 신경 발달 장애 관련 Deubiquitylating Enzymes의 효소 활성 측정

In vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay를 통한 신경 발달 장애 관련 Deubiquitylating Enzymes의 효소 활성 측정

In vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay를 통한 신경 발달 장애 관련 Deubiquitylating Enzymes의 효소 활성 측정

설치류 뇌의 세포외 유비퀴틴-프로테아솜 활동 정량화

세포주 및 조직 샘플에서 Deubiquitinating 효소의 활성을 측정 방법