Gli autori ringraziano Céline Jeanty per la sua assistenza nella creazione di pellet cellulari con trattamento di MG-132 come descritto nei risultati rappresentativi e Elise Mommaerts per la sua fornitura di pellet E. coli utilizzati nel protocollo.

1. Preparazione di uno standard peptidico pesante
<ol><li>A seconda del fornitore e della qualità dei peptidi pesanti acquistati, i peptidi pesanti dovranno essere diluiti. Questo protocollo utilizzava le sequenze peptidiche riportate nella tabella 1, con l'amminoacido C-terminale modificato in lisina(13C615N2-lisina) o arginina (13C615N4-arginina).<ol>
<li>Mescolare i peptidi pesanti, diluire il mix con acetonitrile al 50% (ACN) per creare un mix peptidico con ogni peptide a 10 μM.</li>
		<li>Creare aliquote del mix peptidico e conservare a -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparazione del campione
<ol><li>Lisi campione NOTA: La stabilità delle catene di ubiquitina deve essere considerata durante la preparazione del campione. Conservare i campioni biologici e i tamponi refrigerati a 4 °C e aggiungere campioni al tampone di stabilizzazione dell'ubiquitina il più rapidamente possibile.<ol>
<li>Preparare una soluzione di 1 M NH4HCO3 (bicarbonato di ammonio) in acqua e regolare il pH a 8 utilizzando 1 M NaOH.</li>
		<li>Preparare una soluzione di 200 mM N-etilmaleimide (NEM) in acqua.</li>
		<li>Preparare il buffer di stabilizzazione dell'ubiquitina utilizzando 8 M urea in 50 mM NH4HCO3/10 mM NEM. NOTA: Una soluzione da 5 mL di urea da 8 M richiederà considerevolmente meno di 5 mL di acqua data l'espansione dell'acqua quando si è in una soluzione satura con urea. ATTENZIONE: Non preparare il tampone sopra i 50 °C a causa della tendenza dell'urea a formare poliurea ad alte temperature.</li>
		<li>Resuspend il campione biologico da esaminare in tampone di stabilizzazione dell'ubiquitina con l'obiettivo di 0,5 μg/μL di proteine e di leccare le cellule con un metodo appropriato per il campione. Un metodo di sonicazione composto da tre impulsi da 10 s con un sonificatore SFX 150 Branson impostato al 70% di intensità con 10 s di pause sul ghiaccio tra ogni impulso, è stato utilizzato per le linee cellulari in questo protocollo.</li>
		<li>Campione di centrifuga a 18.000 x g per 10 min a 4 °C in una centrifuga da tavolo.</li>
		<li>Trasferire il supernatante in un tubo di microcentrifugo fresco a basso legame proteico. I campioni possono essere conservati a -20 °C a questo punto, se necessario.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione del campione e dei controlli
	<ol>
<li>Se i campioni sono congelati, mescolare (ad esempio, con un termomixer) mentre vengono scongelati per sciogliere rapidamente l'urea. ATTENZIONE: Non utilizzare temperature superiori a 50 °C a causa della tendenza dell'urea a formare poliurea ad alte temperature.</li>
		<li>Campione di centrifuga a 18.000 x g per 10 min a 4 °C in una centrifuga da tavolo.</li>
		<li>Trasferire 20 μg di campione in un nuovo tubo di microcentrifugo a bassa lega e regolare il volume a 50 μL con tampone di stabilizzazione dell'ubiquitina.</li>
		<li>Creare un controllo negativo utilizzando un volume normalizzato di buffer di stabilizzazione dell'ubiquitina (50 μL). In questo campione non deve essere presente alcuna versione leggera di ciascun peptide, consentendo l'osservazione di qualsiasi contaminazione leggera derivante dai peptidi pesanti a spillo. Questo controllo negativo è stato utilizzato anche per la pianificazione del tempo di conservazione del PRM descritto nella sezione 3.1.</li>
		<li>È stato anche creato un controllo positivo con buffer di stabilizzazione dell'ubiquitina e l'aggiunta di tipi di catena disponibili in commercio al volume normalizzato di buffer di stabilizzazione dell'ubiquitina (50 μL). Comunemente, K63, K48 e M1 sono disponibili. Nei risultati rappresentativi sono stati utilizzati 20 ng di K48, K63 e M1.</li>
	</ol></li>
	<li>Riduzione, alchilazione e digestione
	<ol>
<li>Preparare una soluzione di bicarbonato di ammonio da 50 mM (NH4HCO3) in acqua e regolare il campione in pH = 8 con 1 M NaOH.</li>
		<li>Una coltura di E. coli coltivata in brodo LB è stata centrifugata 5.000 x g per 5 minuti per formare un pellet, che è stato poi lavato 2 volte con PBS prima della resuspensione in tampone di stabilizzazione ubiquitina a 5 μg/μL.</li>
		<li>Aggiungere 1 μg di E. coli lysate a ciascun campione e controllare. Questo protocollo utilizza E. coli (DH10B), ma è possibile utilizzare qualsiasi lisato complesso senza ubiquitina. Si noti che l'ubiquitina è comune a tutti gli eucarioti. NOTA: L'uso di una matrice di lisato E. coli riduce la perdita di peptidi a causa dell'adesione non specifica alle stoviglie. Ciò è particolarmente evidente nel controllo negativo o nei campioni con un contenuto proteico limitato e ha un forte impatto sull'osservazione di K6312.</li>
		<li>Preparare una soluzione di 500 mM tris(2-carbossietile)fosfina (TCEP) in acqua di grado MS (DTT può essere utilizzato come alternativa).</li>
		<li>Ridurre i campioni e i controlli con l'aggiunta di TCEP a una concentrazione finale di 50 mM. Vortice brevemente prima di incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (RT). Se si utilizza DTT, la temperatura deve essere elevata a 50 °C. ATTENZIONE: Non utilizzare temperature superiori a 50 °C a causa della tendenza dell'urea a formare poliurea ad alte temperature.</li>
		<li>Preparare una soluzione di 550 mM di cloroacetamide (CAA) in NH4HCO3. Conservare al buio.</li>
		<li>Alchilato i campioni e i controlli aggiungendo CAA ad una concentrazione finale di 55 mM. Vortice brevemente prima di incubare per 20 minuti a RT al buio. NOTA: CAA viene utilizzato al posto dell'iodoacetamide come agente di riduzione per ridurre la possibilità di una doppia modifica carbamidometile (114.0429) su un residuo di lisina scambiato per una modifica -GG (114.0429)13.</li>
		<li>Aggiungere l'endopeptidasi LysC ai campioni con un rapporto 1:25 (w/w) con il contenuto proteico. Incubare per 3 ore a 37 °C.</li>
		<li>Diluire i campioni e i comandi con 200 μL di 50 mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v).</li>
		<li>Aggiungere la tripsidena ai campioni con un rapporto di 1:25 w/w con il contenuto proteico. Incubare per 12 ore a 37 °C.</li>
		<li>Aggiungere la soluzione di acido formico (FA) al 10% in acqua di grado MS con un rapporto 1:10 v/v a ciascun campione e campione di controllo. Verificare che il pH sia <3) prima della pulizia C18 e aggiungere altro acido formico, se necessario.</li>
		<li>Ad ogni campione e controllo aggiungere 0,5 μL dello standard peptidico pesante creato nella sezione 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Pulizia peptidica
	<ol>
<li>Diversi produttori offrono punte o piastre di pulizia C18. Seguire le istruzioni del produttore per il prodotto utilizzato e i peptidi elusi secchi in una centrifuga sottovuoto, pronti per l'analisi ms.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analisi di LC-MS/MS
<ol><li>Esegui l'analisi PRM iniziale sullo standard peptidico pesante in modo non programmato.<ol>
<li>Resuspend i campioni essiccati in 10 μL di tampone di carico MS 2% ACN/0,05% acido trifluoroacetico (TFA).</li>
		<li>Equipaggia un HPLC con una colonna analitica C18 in fase inversa (75 μm x 15 cm, 2 μm 100 Å C18 perline) progettata per il nanoflusso MS. Una colonna trappola sacrificale (75 μm x 2 cm, 3 μm, 100 Å C18 perline) per preservare la vita della colonna analitica è stata utilizzata qui ma non è richiesta.</li>
		<li>Accoppiare l'output della colonna analitica a una sorgente nano-ESI su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione.</li>
		<li>Utilizzare un metodo di proteomica mirato appropriato per lo spettrometro di massa. Ad esempio, su un Q-Exactive più un metodo a due esperimenti, scorrere tra un full MS e un esperimento PRM. Per l'esperimento Full MS è stata utilizzata una risoluzione di 120.000 con un obiettivo AGC di 1e6 e 240 ms come IT massimo. Per l'esperimento PRM, lo stesso obiettivo AGC e l'IT massimo sono stati utilizzati con una risoluzione inferiore di 60.000 e una finestra di isolamento di 1,2 m/z.</li>
		<li>Iniettare 200 ng del controllo negativo sulla colonna analitica utilizzando l'autocampionatore HPLC. Applicare un gradiente lineare al campione sulla colonna analitica aumentando la concentrazione di ACN dal 2 al 25% in un periodo di ~45 min. NOTA: La concentrazione di ACN del 25% è inferiore al solito per la proteomica a causa della bassa natura idrofila dei tipici peptidi caratteristici della topologia dell'ubiquitina. Se altri peptidi devono essere quantificati, si può desiderare una maggiore concentrazione di ACN per ottenere una buona separazione del bersaglio.</li>
		<li>Analizzare i risultati dell'esecuzione della programmazione come descritto nella sezione 4.2 per creare un elenco di inclusione pianificato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analisi dei campioni<ol>
<li>Eseguire gli esempi rimanenti come descritto per la programmazione in 3.1 a parte l'utilizzo dell'elenco di inclusione pianificato creato nella sezione 4.2. NOTA: un vuoto deve essere eseguito dopo il controllo positivo per garantire che non venga rilevato alcun riporto dall'esecuzione precedente nei campioni successivi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Analisi del software
<ol><li>Creare un elenco di inclusione della formattazione appropriata per l'MS utilizzato. Questo protocollo utilizzava il software open source Skyline (versione 19.1.0.193) (https://skyline.ms), che offre supporto e aiuto ben documentati. È possibile creare un elenco di inclusione per diversi spettrometri di massa utilizzando la struttura dell'elenco di isolamento delle esportazioni.<ol>
<li>Aprire un nuovo documento Skyline.</li>
		<li>Selezionare modifiche isotopiche pesanti in base alle esigenze dei peptidi caratteristici della topologia pesante. In Impostazioni| Impostazioni peptidice nella scheda Modifica fare clic sul campo nome per visualizzare la potenziale modifica. La selezione si basa sullo stato isotopico dei peptidi pesanti acquistati. In questo esempio sono stati utilizzati peptidi sintetici che trasportano una lisina pesante (13C615N2-lisina) o un'arginina pesante(13C615N4-arginina) al C-terminale. Le etichette appropriate sarebbero: "Label:13C(6)15N(2) (C-term K)" e "Label:13C(6)15N(4) (C-term R)".</li>
		<li>Selezionare Impostazioni| Transizione. Nella scheda Filtro sono includono Precursor Charges 2, 3, 4.</li>
		<li>Inserire peptidi selezionando Modifica| Inserisci| Peptidi.</li>
		<li>Compilare i campi rilevanti, inclusa la sequenza peptidica caratteristica della topologia e un nome proteico (ad esempio, "Catena-K63").</li>
		<li>Espandete ogni peptide ora mostrato nel pannello Bersagli. Eliminare gli stati di addebito indesiderati. Lo stato di carica preferito e l'energia di collisione, che possono differire in base allo spettrometro di massa utilizzato, per ogni peptide caratteristico della topologia è mostrato nella tabella 1.</li>
		<li>Per ogni peptide caratteristico della topologia (ad eccezione di M1 in cui il GG è incluso nella sequenza), fare clic con il pulsante destro del mouse sulla sequenza e scegliere Modifica. Aggiungere un GG come modifica strutturale facendo clic sul campo nome e selezionando <Mostra tutto... > prima di selezionare "GlyGly (K)".</li>
		<li>Esportare l'elenco di isolamento File| Esporta| Elenco diisolamento , selezionare il tipo di strumento e impostare il tipo di metodo su Standard. Selezionando OK verrà aperto un prompt per salvare un file *.csv che può essere utilizzato per creare un metodo PRM.</li>
	</ol></li>
	<li>Crea un elenco di inclusione pianificato basato su un'esecuzione di pianificazione peptidica pesante spiegata qui utilizzando il software Skyline open source.<ol>
<li>Creare un elenco di destinazione come descritto nella sezione 4.1.</li>
		<li>Importare l'esecuzione della pianificazione in 3.1 selezionando File| Importa| Risultati.</li>
		<li>Rivedere le identificazioni. Il segnale pesante per ogni peptide è osservabile cliccando sulla massa per ogni ingresso peptidico pesante. Il corretto riconoscimento del picco viene spesso determinato automaticamente, ma il software potrebbe richiedere la cura manuale selezionando il picco utilizzando il clic e il trascinamento sotto l'asse x.</li>
		<li>I tempi di ritenzione selezionati per le varianti pesanti vengono applicati anche alle versioni leggere, creando così una pianificazione per il PRM. La finestra di pianificazione può essere modificata in Impostazioni| Impostazioni peptidiche mediante la scheda Previsione, modificando la finestra di tempo.</li>
		<li>Un elenco di inclusione pianificato può ora essere esportato utilizzando File| Esporta| Elenco di isolamento e selezione del tipo di strumento appropriato e impostazione del tipo di metodo su Programmato.</li>
	</ol></li>
	<li>Analizzare i dati.<ol>
<li>Importare i campioni nello stesso modo dell'analisi di esecuzione della programmazione nella sezione 4.2.</li>
		<li>Dopo l'importazione completa di tutti i campioni, si consiglia la cura delle transizioni. Questo è il processo attraverso il quale vengono rimosse le transizioni con interferenze o scarsi rapporti segnale-rumore. Un esempio di cromatogramma prima e dopo la cura è illustrato nella figura 4.</li>
		<li>I dati possono ora essere esportati facendo clic con il pulsante destro del mouse sui grafici pertinenti e selezionando Copia dati o selezionando File| Esporta| Risultati.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

L'analisi dello stato di ubiquitina all'interno di un proteoma è sempre più importante per un'ampia varietà di questioni biologiche. La descrizione dello stato di ubiquitinazione di un campione deve concentrarsi non solo sul profilo delle proteine ubiquitinate, ma anche sulla topologia di tale ubiquitinazione. La valutazione di questa topologia da parte degli Stati membri mirati, come descritto in questa sede, ha un ruolo in un'ampia gamma di indagini biologiche.
Va capito che il protocollo...

La stretta regolazione della funzione e della stabilità proteica è di fondamentale importanza, in quanto sono i principali motori del controllo fenotipico della biologia. La funzione di una proteina è costruita da due componenti: la sua sequenza intrinseca di polipeptidi e qualsiasi modificazione posttraslazionale (PTM). Sono state identificate varie PTM chimiche tra cui glicosilazione, fosforilazione, acetilazione e metilazione1. Nel 1975, Goldstein etal. L'ubiquitina è stata trovata importante nella degradazione delle proteine3. Tuttavia, da allora è stato stabilito che la funzione dell'ubiquitina come molecola di segnalazione si estende ben oltre la regolazione della stabilità proteica. La segnalazione dell'ubiquitina è coinvolta in una vasta gamma di altre funzioni biologiche, come la stabilizzazione delle proteine, l'autofagia, il controllo del ciclo cellulare e il trafficoproteico 4.
Mentre altre PTM sono generalmente binarie (cioè, la proteina viene modificata o lasciata non modificata) per un dato sito, l'ubiquitina può modificare una proteina sia come monomero che come catena polimerica, con l'ubiquitinazione stessa attaccata. Inoltre, questa catena di poliubiquitinazione può svilupparsi in diverse topologie con l'ubiquitinazione della precedente ubiquitina allegandosi a uno degli otto siti di collegamento5,6. L'ubiquitina viene trasferita da un processo enzimatico multipasso (Figura 1) in cui il C-terminale dell'ubiquitina è collegato a uno dei suoi sette residui di lisina (K06, K11, K27, K29, K33, K48 o K63) o all'N-terminale dell'ubiquitina precedente (indicato come m1 o ubiquitinazione lineare)5,6. Questa topologia a catena è la chiave del destino della proteina in fase di modifica. Ad esempio, la modifica con una catena collegata K48 o K11 porta alla degradazione della proteina modificata al proteasome, mentre una catena lineare è necessaria per l'attivazione della segnalazione NF-kB. Pertanto, la distribuzione relativa di queste topologie a catena è rilevante per un'ampia varietà di questioni biologiche.
L'uso della spettrometria di massa (SM) è di particolare beneficio per l'analisi della topologia della catena di ubiquitina in quanto non dipende da interazioni basate suanticorpi o affinità 7,8, molte delle quali hanno una specificità limitata e non distinguono tra i vari tipi di catena. Un'altra possibilità di rilevamento è l'uso di mutanti ubiquitina geneticamente modificati. Qui, una lysina specifica viene scambiata con arginina, che non può supportare la modifica con ubiquitina. La mancanza di formazione di catena di ubiquitina sulla proteina del substrato viene quindi interpretata come prova di una topologiaspecifica 9.
L'identificazione basata sulla SM delle proteine ubiquitinate si basa sul fatto che il C-terminale dell'ubiquitina contiene un residuo di arginina nella posizione 74 che è riconosciuto dalla trippasina durante la preparazione proteolitica dei campioni per l'analisi MS, separando la doppia glicina C-terminale. Questo GlyGly (-GG) rimane attaccato al ε-ammino del residuo di lisina della proteina del substrato. Per l'analisi della topologia dell'ubiquitina, la modifica avviene su uno dei sette residui di lisina dell'ubiquitina. In questo modo viene creato un insieme di sette peptidi chiave che trasportano un residuo di lisina modificato da GG, specifico per ciascuna delle topologie (Figura 2). Ad esempio, con la topologia K06, la lisina in posizione 6 sulla sequenza amminoacido sarà protetta dalla digestione triptica con una modifica -GG di 114 Da aggiunta a questa lisina.
L'identificazione di peptidi predeterminati specifici da parte della SM è indicata come proteomica mirata, o più specificamente, acquisizione mirata di peptidi10. Sono stati sviluppati due metodi a seconda delle prestazioni dello spettrometro di massa utilizzato. Questi sono il monitoraggio della reazione selezionata (SRM), chiamato anche monitoraggio della reazione multipla (MRM) e monitoraggio della reazione parallela (PRM). L'SRM comporta la selezione di transizioni costituite dal precursore m/z e dal prodotto ione m/z. Al contrario, il PRM richiede solo il precursore m/z. Dopo la selezione, viene eseguita una scansione completa del sondaggio degli ioni prodotto. Ciò ha il vantaggio che non è necessaria alcuna selezione di ioni di prodotto appropriati per la quantificazione sullo spettrometro di massa specifico prima della misurazione11. Sia SRM che PRM possono, a seconda dello strumento, essere programmati. La programmazione è la pratica di assegnare un lacime temporale durante il quale un particolare ione sarà incluso per l'analisi, poiché i peptidi stanno eluendo in tempi di conservazione definiti dal sistema cromatografico. La riduzione del numero di ioni interrogati in un dato momento aumenta la frequenza di interrogatorio degli ioni programmati in quel momento, migliorando così l'accuratezza dei dati.
In generale, l'applicazione di proteomica mirata per la topologia dell'ubiquitina è la stessa di qualsiasi altro esperimento di proteomica mirato. Tuttavia, due differenze chiave sono importanti: in primo luogo, deve essere considerata la stabilità delle catene di ubiquitina. Ci sono più potenti enzimi deubiquitinanti (DBA) che degradano rapidamente le catene sulla lisi cellulare. Le proteasi ubiquitina-specifiche si suddividono in due categorie: le tioesterasi e le metalloproteasi. La maggior parte delle ubiquitina-idrolasi sono tioesterasi e trasportano un residuo di cisteina nel loro centro attivo. Alchilando questo residuo di cisteina, possono essere inattivati. Come tale, l'uso di tamponi di stabilizzazione dell'ubiquitina contenenti agenti alchilanti, come la N-etilmaleimide (NEM), e sostanze chimiche altamente denaturanti, e mantenere i campioni refrigerati è vitale per un'analisi di successo. In secondo luogo, a differenza di altri esperimenti mirati, la scelta peptidica è fissa. In un tipico esperimento mirato, un peptide proteotipico può essere selezionato per buone prestazioni cromatografiche e ionizzazioni. Per alcuni peptidi caratteristici della topologia come K48 queste proprietà sono buone, mentre per altre sono meno desiderabili. Ad esempio, la cromatografia K33 in una tipica configurazione in fase inversa è scarsa a causa della formazione di un profilo di eluizione allungato e le scarse proprietà di ionizzazione del peptide K27 riducono la sua visibilità di MS12.
In questo protocollo, descriviamo come eseguire la valutazione della topologia dell'ubiquitina di un campione biologico da parte del PRM. I dati di esempio per la procedura sono presentati utilizzando una perturbazione del proteasome utilizzando il trattamento inibitore MG-132 in diversi tipi di cellule.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrile (ACN)</td><td>Merck</td><td>100029</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate (ABC)</td><td>Fluka</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 16</td><td></td></tr><tr><td>Chloroacetamide (CAA)</td><td>Sigma</td><td>22790</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid (FA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85178</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Peptides</td><td>JPT Peptide Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Dionex</td><td>Ulitimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>LC Column</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>160321</td><td></td></tr><tr><td>Lys C</td><td>Wako</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>Mass Spectrometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q-Exactive Plus</td><td></td></tr><tr><td>N-ethylmaleimide (NEM)</td><td>ACROS Organics</td><td>156100050</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Chain K48</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-240</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Chain K63</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-340-100</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Chain M1</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-710B-025</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier</td><td>Branson sonifier</td><td>SFX 150</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer Comfort</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td><td>Sigam</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>77720</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>V1511A</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>Waters &amp;mu;Elution C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt; plates</td><td>Waters</td><td>186002318</td><td></td></tr></tbody></table>

ubiquitin chain analysis by parallel reaction monitoring

La valutazione del profilo globale delle topologie a catena di ubiquitina all'interno di un proteoma è interessante per rispondere a un'ampia gamma di domande biologiche. Il protocollo qui delineato sfrutta la modifica della diglicina (-GG) lasciata dopo la digestione triptica dell'ubiquitina incorporata in una catena. Quantificando questi peptidi caratteristici della topologia si può determinare l'abbondanza relativa di ogni topologia a catena di ubiquitina. Le misure necessarie per quantificare questi peptidi mediante un esperimento parallelo di monitoraggio della reazione sono riportate tenendo conto della stabilizzazione delle catene di ubiquitina. La preparazione di controlli pesanti, lisi cellulare e digestione sono descritti insieme all'appropriata configurazione dello spettrometro di massa e al flusso di lavoro di analisi dei dati. Viene presentato un set di dati di esempio con perturbazioni nella topologia ubiquitina, accompagnato da esempi di come l'ottimizzazione del protocollo può influire sui risultati. Seguendo i passaggi descritti, un utente sarà in grado di eseguire una valutazione globale del paesaggio della topologia dell'ubiquitina all'interno del proprio contesto biologico.

Per dimostrare l'uso di un'analisi della catena di ubiquitina da parte del PRM, sono state selezionate tre linee cellulari: una linea cellulare di melanoma del topo B16 e le due comuni linee cellulari umane A549 (cellule epiteliali basali alveolari adenocarcinomiche) e HeLa (cellule tumorali cervicali). Queste colture sono cresciute fino alla fase semiesonziale in mezzi appropriati prima di essere trattate con 0, 10 o 100 mM MG-132 per 4 ore prima della raccolta. MG-132 è un inibitore del proteasome che impedisce la deg...

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Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Questo metodo descrive la valutazione dei cambiamenti globali nella topologia della catena di ubiquitina. La valutazione viene eseguita mediante l'applicazione di un approccio di proteomica mirata basato sulla spettrometria di massa.

Analisi della catena Ubiquitin mediante monitoraggio parallelo della reazione

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

ubiquitin-chain-analysis-by-parallel-reaction-monitoring

Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.5K Views.  Luxembourg Institute of Health. Questo metodo descrive la valutazione dei cambiamenti globali nella topologia della catena di ubiquitina. La valutazione viene eseguita mediante l'applicazione di un approccio di proteomica mirata basato sulla spettrometria di massa.

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Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which may be essential for a given protein&#39;s role both physiologically and pathologically. Enrichment of PTMs is often necessary when investigating the PTM status of a target protein, because PTMs are often transient and relatively low in abundance. Many pitfalls are encountered when enriching for a PTM of a target protein, such as buffer incompatibility, the target protein antibody is not IP-compatible, loss of PTM signal, and others. The degree of difficulty is magnified when investigating multiple PTMs like acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, and tyrosine phosphorylation for a given target protein. Studying a combination of these PTMs may be necessary, as crosstalk between PTMs is prevalent and critical for protein regulation. Often, these PTMs are studied in different lysis buffers and with unique inhibitor compositions. To simplify the process, a unique denaturing lysis system was developed that effectively isolates and preserves these four PTMs; thus, enabling investigation of potential crosstalk in a single lysis system. A unique filter system was engineered to remove contaminating genomic DNA from the lysate, which is a problematic by-product of denaturing buffers. Robust affinity matrices targeting each of the four PTMs were developed in concert with the buffer system to maximize the enrichment and detection of the endogenous states of these four PTMs. This comprehensive PTM detection toolset streamlines the process of obtaining critical information about whether a protein is modified by one or more of these PTMs.

Investigating multiple, endogenous post-translational modifications for a target protein can be extremely challenging. Techniques described here utilize an optimized lysis buffer and filter system developed with specific PTM-targeting, affinity matrices to detect the acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, and tyrosine phosphorylation modifications for a target protein using a single, streamlined system.

Che utilizzano un sistema di arricchimento di immunoprecipitazione completa per identificare un profilo di modificazione post-traduzionale endogeno per proteine bersaglio

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Ricerca

Biochimica

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

Profilazione delle modifiche post-traduzionali dipendenti da Ubiquitin e Ubiquitine e identificazione di alterazioni significative

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

Rilevamento di proteine ​​Ubiquitinazione

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Biologia

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, including cell survival, proliferation, and differentiation. It is a reversible process that consists of a covalent attachment of ubiquitin to the substrate through a cascade reaction of at least three different enzymes, composed of E1 (Ubiquitin-activation enzyme), E2 (Ubiquitin-conjugating enzyme), and E3 (Ubiquitin-ligase enzyme). The E3 complex plays an important role in substrate recognition and ubiquitylation. Here, a protocol is described to evaluate substrate ubiquitylation in mammalian cells using transient co-transfection of a plasmid encoding the selected substrate, an E3 ubiquitin ligase, and a tagged ubiquitin. Before lysis, the transfected cells are treated with the proteasome inhibitor MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) to avoid substrate proteasomal degradation. Furthermore, the cell extract is submitted to small-scale immunoprecipitation (IP) to purify the polyubiquitylated substrate for subsequent detection by western blotting (WB) using specific antibodies for ubiquitin tag. Hence, a consistent and uncomplicated protocol for ubiquitylation assay in mammalian cells is described to assist scientists in addressing ubiquitylation of specific substrates and E3 ubiquitin ligases.

We provide a detailed protocol for a ubiquitylation assay of a specific substrate and an E3 ubiquitin-ligase in mammalian cells. HEK293T cell lines were used for protein overexpression, the polyubiquitylated substrate was purified from cell lysates by immunoprecipitation, and resolved in SDS-PAGE. Immunoblotting was used to visualize this post-translational modification.

Valutazione dell'ubiquitilazione del substrato mediante ubiquitina-ligasi E3 nei lisati a cellule di mammifero

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Valutazione delle varianti DUB nei disturbi del neurosviluppo utilizzando un test di clivaggio

Measuring Enzymatic Activity of Neurodevelopmental Disorder-Associated Deubiquitylating Enzymes via an In Vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. Discrete disorders caused by single genes provide models to investigate mechanisms driving atypical neurodevelopment. Variants of genes encoding deubiquitylating enzyme (DUB) family proteins are associated with several NDDs, but there is a need to determine the pathogenic mechanisms of disorders driven by these gene variants. The impact of gene variants on DUB activity can be experimentally determined using a substrate-independent in vitro ubiquitin cleavage assay. This assay does not require knowledge of downstream substrates to directly measure catalytic activity. Here, the protocol for determining the impact of gene variants on enzymatic activity is modeled using the DUB Ubiquitin Specific Protease 27, X-linked (USP27X), which is mutated in X-linked intellectual disability 105 (XLID105). This experimental pipeline can be used to clarify the mechanisms underlying neurodevelopmental disorders driven by variants in DUB genes.

<meta charset="utf8"></head><body>Misurazione dell'attività enzimatica degli enzimi deubiquitilanti associati a disturbi dello sviluppo neurologico tramite un saggio in vitro di scissione della cat

This protocol explains how to measure the effect of genetic variation associated with neurodevelopmental disorders on deubiquitylating enzyme activity by combining recombinant protein purification with ubiquitin chain cleavage assays.

Misurazione dell'attività enzimatica degli enzimi deubiquitilanti associati a disturbi dello sviluppo neurologico tramite un saggio in vitro di scissione della catena dell'ubiquitina

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. ...

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases in ubiquitin-proteasome activity are critical for synaptic plasticity and memory formation and aberrant changes in this system are associated with a variety of neurological, neurodegenerative and psychiatric disorders. One of the issues in studying ubiquitin-proteasome functioning in the brain is that it is present in all cellular compartments, in which the protein targets, functional role and mechanisms of regulation can vary widely. As a result, the ability to directly compare brain ubiquitin protein targeting and proteasome catalytic activity in different subcellular compartments within the same animal is critical for fully understanding how the UPS contributes to synaptic plasticity, memory and disease. The method described here allows collection of nuclear, cytoplasmic and crude synaptic fractions from the same rodent (rat) brain, followed by simultaneous quantification of proteasome catalytic activity (indirectly, providing activity of the proteasome core only) and linkage-specific ubiquitin protein tagging. Thus, the method can be used to directly compare subcellular changes in ubiquitin-proteasome activity in different brain regions in the same animal during synaptic plasticity, memory formation and different disease states. This method can also be used to assess the subcellular distribution and function of other proteins within the same animal.

This protocol is designed to efficiently quantify ubiquitin-proteasome system (UPS) activity in different cellular compartments of the rodent brain. Users are able to examine UPS functioning in nuclear, cytoplasmic and synaptic fractions in the same animal, reducing the amount of time and number of animals needed to perform these complex analyses.

Quantificare l'attività subcellulare ubiquitina-proteasoma nel cervello del roditore

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...

Neuroscienze

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, techniques for studying the regulatory mechanism of this system are essential to elucidating the cellular and molecular processes of the aforementioned diseases. The use of hemagglutinin derived ubiquitin probes outlined in this paper serves as a valuable tool for the study of this system. This paper details a method that enables the user to perform assays that give a direct visualization of deubiquitinating enzyme activity. Deubiquitinating enzymes control proteasomal degradation and share functional homology at their active sites, which allows the user to investigate the activity of multiple enzymes in one assay. Lysates are obtained through gentle mechanical cell disruption and incubated with active site directed probes. Functional enzymes are tagged with the probes while inactive enzymes remain unbound. By running this assay, the user obtains information on both the activity and potential expression of multiple deubiquitinating enzymes in a fast and easy manner. The current method is significantly more efficient than using individual antibodies for the predicted one hundred deubiquitinating enzymes in the human cell.

The current protocol details a method for measuring the activity of functionally homologous deubiquitinating enzymes. Specialized probes covalently modify the enzyme and allow for detection. This method holds the potential to identify new therapeutic targets.

Metodo per la misurazione dell&#39;attività di Deubiquitinating enzimi in linee di cellule e tessuti Campioni

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Analisi della catena Ubiquitin mediante monitoraggio parallelo della reazione

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Che utilizzano un sistema di arricchimento di immunoprecipitazione completa per identificare un profilo di modificazione post-traduzionale endogeno per proteine bersaglio

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

Profilazione delle modifiche post-traduzionali dipendenti da Ubiquitin e Ubiquitine e identificazione di alterazioni significative

Rilevamento di proteine Ubiquitinazione

Valutazione dell'ubiquitilazione del substrato mediante ubiquitina-ligasi E3 nei lisati a cellule di mammifero

Misurazione dell'attività enzimatica degli enzimi deubiquitilanti associati a disturbi dello sviluppo neurologico tramite un saggio in vitro di scissione della catena dell'ubiquitina

Misurazione dell'attività enzimatica degli enzimi deubiquitilanti associati a disturbi dello sviluppo neurologico tramite un saggio in vitro di scissione della catena dell'ubiquitina

Misurazione dell'attività enzimatica degli enzimi deubiquitilanti associati a disturbi dello sviluppo neurologico tramite un saggio in vitro di scissione della catena dell'ubiquitina

Quantificare l'attività subcellulare ubiquitina-proteasoma nel cervello del roditore

Metodo per la misurazione dell'attività di Deubiquitinating enzimi in linee di cellule e tessuti Campioni

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