我们的酶方法使用具有受控聚合度的蛋白寡聚物。它是单分子力光谱学研究以及基于蛋白质的材料结构的完美样品制备。我们的方法不引入半胱氨酸的目标蛋白质。
由于半胱氨酸是蛋白质最重要的功能残留物之一，它有利于聚合物质蛋白或酶的构建。演示程序将是邓一兵和石胜超，我实验室的研究生。首先，在烧杯中将20克铬酸钾溶解在40毫升的超纯水中。
在二氯酸钾溶液中慢慢加入360毫升浓缩硫酸，并使用玻璃棒轻轻搅拌。将玻璃盖玻片放入铬酸中，在80摄氏度下将其转移到烤箱中30分钟。用水清洁盖玻片，然后用绝对乙醇清洁盖玻片，然后用氮流干燥盖玻片。
在室温下，将盖玻片完全浸入 1% 体积的 APTES 甲苯溶液中，在室温下浸泡一小时，同时保护其免受光线影响。首先用甲苯清洗盖玻片，然后用绝对乙醇清洗盖玻片，然后用氮气流擦干盖玻片。在80摄氏度下孵育盖玻片15分钟，然后让它冷却至室温。
在两个固定盖玻片和孵育一小时之间，使用移液器在 DMSO 溶液中加入 200 微升，每毫升 Sulfo-SMCC 1 毫克。一小时后，先用 DMSO 清洗盖玻片，然后用绝对乙醇清洗，以去除残留的 Sulfo-SMCC。在氮气流下干燥盖玻片。
200微摩尔GL-ELP-50 cys蛋白溶液的60微升，在功能化盖玻片上，在25摄氏度下孵育约3小时。之后，用超纯水清洗盖玻片，以去除未反应的 GL-ELP-50-cys。要准备功能化悬臂表面，首先将悬臂浸入铬酸中，并在 80 摄氏度下清洁悬臂，10 分钟。
用水和绝对乙醇洗去酸。将悬臂浸入1%体积的APTES甲苯溶液中，在塑料管盖中进行一小时的氨基盐化。用绝对乙醇冲洗悬臂，然后在80摄氏度下烘烤悬臂15分钟。
将悬臂浸入 Sulfo-SMCC 溶液中一小时，然后用绝对乙醇冲洗悬臂。要将囊-ELP-50-NGL 与表面连接，请将囊-ELP-50-NGL 中的连形器与 Sulfo-SMCC 的雄胺组浸入 1.5 小时。然后用超纯水洗去悬臂上未反应的囊-ELP-50-NGL。
接下来，将功能化悬臂浸入含有 200 微升 50 微摩尔 GL-CBM-XDockerin 蛋白溶液和 200 纳米摩尔 OaAEP1 溶液的溶液中，并在 25 摄氏度下放置 20 至 30 分钟。然后使用AFM缓冲液洗去未反应的蛋白质。在AFM实验之前洗去未反应的残余蛋白质至关重要，因为它将形成一个鳕欣-多金对和块悬臂，以在表面接受新的蛋白质。
要将感兴趣的-NGL的结扎单元cohesin-T-L-protein与固定在盖玻片表面的GL-ELP-50连接，在盖玻片上加入15微升OAAEP1，让它孵育30分钟。使用 15 到 20 毫升的 AFM 缓冲液洗去任何未反应的蛋白质。加入100微升的TEV蛋白酶，在25摄氏度的TEV识别点切割蛋白质单元一小时。
然后使用15至20毫升AFM缓冲液洗去残留蛋白质。将感兴趣的-NGL的结扎单元cohesin-T-L-蛋白与OAAEP1的GL-泛素-NGL玻璃连接30分钟。根据蛋白质结构GL-泛素-NGL要建立在玻璃表面，重复多蛋白制备步骤n1次。
省略最后一个 TEV 裂解反应，将蛋白聚合物上的 cohesin 作为 cohesin-TEV-L-泛素-n-NGL 玻璃。在AFM液室中加入一毫升AFM缓冲液，加入10毫摩尔氯化钙和5毫摩尔抗坏血酸。为实验选择功能化 AFM 探头的 D 尖端。
将探头浸入 AFM 缓冲区中。以 400 纳米/秒的恒定速度从表面缩回悬臂。同时，以 4，000 赫兹的采样率记录力延伸曲线。
在每次实验前，使用装备定理校准AFM缓冲液中的悬臂，并采用精确的弹簧常数K值。将用码头素功能化的悬臂尖端连接到蛋白沉积表面，用鳕欣功能化，形成鳕欣-多金对。然后打开JPK数据处理软件，选择具有特色的锯齿型和高分离力的力延伸曲线。
在这项研究中，OaAEP1结扎在相邻蛋白质之间引入的NGL残留物不影响聚合物中的蛋白质单体稳定性，其表达为展开力，反长增量与先前的研究相当。铁质鲁布雷多辛的纯化呈现了495纳米和575纳米的典型UV可视化吸收峰值，而锌形态则没有。 步进消化和结扎的SDS页面凝胶结果表明，TEV-L-泛素、TEV裂解、纯GFP-TEV-蛋白酶和纯化产品GL-泛素的结果蛋白混合物。
带无OAAEP1和纯OAAEP1的切割GL-泛素和cohesin-TEV-L-泛素结扎混合物也显示。使用有源的 Sulfo-SMCC 使表面功能化至关重要，以成功进行肽附件。在这里，我们提供了一种制造聚合蛋白的新方法。
它便于研究人员使用单分子力光谱研究复杂的蛋白质系统。铬酸具有很强的腐蚀性和酸性。准备和处理它时要小心。
