Nosso método enzimático usa oligômero proteico com um número controlado de grau de polimerização. É uma preparação perfeita de amostra para o estudo de espectroscopia de força de molécula única, bem como construção de material à base de proteínas. Nosso método não introduz cisteína na proteína alvo.
Como a cisteína é um dos resíduos funcionais mais importantes para a proteína, facilita a construção de proteínas de matéria polimerizada ou enzimas. Demonstrando o procedimento serão Yibing Deng e Shengchao Shi, estudantes de pós-graduação do meu laboratório. Para começar, dissolva 20 gramas de cromato de potássio em 40 mililitros de água ultrapura em um béquer.
Adicione lentamente 360 mililitros de ácido sulfúrico concentrado à solução de dicromato de potássio e use uma haste de vidro para mexer suavemente. Coloque uma mancha de vidro no ácido cromado e transfira-o para um forno a 80 graus Celsius por 30 minutos. Limpe a tampa com água e, em seguida, álcool etílico absoluto e seque a tampa com um fluxo de nitrogênio.
Imerque completamente o deslizamento de cobertura em 1% de volume por volume SOLUÇÃO de tolueno APTES por uma hora à temperatura ambiente, protegendo-os da luz. Lave a tampa com tolueno primeiro e depois com álcool etílico absoluto e seque a tampa com um fluxo de nitrogênio. Incubar a tampa a 80 graus Celsius por 15 minutos e depois deixe esfriar até a temperatura ambiente.
Use uma pipeta para adicionar 200 microliters de um miligrama por mililitro Sulfo-SMCC na solução DMSO entre dois deslizamentos imobilizados e incubar por uma hora protegido da luz. Após uma hora, lave as tampas com DMSO primeiro e depois com álcool etílico absoluto para remover sulfo-SMCC residual. Seque a mancha sob um fluxo de nitrogênio.
Pipeta 60 microliters de 200 micromolar gl-ELP-50 cys-protein solução em um deslizamento de cobertura funcionalizado e incubar a 25 graus Celsius por cerca de três horas. Depois disso, lave o deslizamento com água ultrapura para remover o GL-ELP-50-cys não redigido. Para preparar a superfície cantilever funcionalizada, primeiro mergulhe os cantilevers em ácido cromômico e limpe os cantilevers a 80 graus Celsius por 10 minutos.
Use água e álcool etílico absoluto para lavar o ácido. Mergulhe a cantilever com 1% de volume por volume solução de tolueno APTES para realizar a salinização de amino em uma tampa de tubo plástico por uma hora. Enxágüe o cantilever com álcool etílico absoluto e depois asse o cantilever a 80 graus Celsius por 15 minutos.
Mergulhe a cantilever na solução Sulfo-SMCC por uma hora e enxágue o cantilever com álcool etílico absoluto. Para ligar o cys-ELP-50-NGL à superfície, mergulhe os cantilevers no cys-ELP-50-NGL com o grupo maleimide de Sulfo-SMCC por 1,5 horas. Em seguida, lave os cis-ELP-50-NGL não redigidos na cantilever por água ultrapura.
Em seguida, mergulhe uma cantilever funcionalizada em uma solução contendo 200 microlitros de 50 micromolar solução de proteína GL-CBM-XDockerin com 200 nanomolar OaAEP1 e coloque-os a 25 graus Celsius por 20 a 30 minutos. Em seguida, use o tampão AFM para lavar a proteína não redigida. É fundamental lavar a proteína residual não redigida antes do experimento AFM porque formará um par de cohesin-dockerin e o bloco o cantilever para tomar novas proteínas na superfície.
Para ligar a unidade de ligadura cohesin-T-L-protein de interest-NGL ao GL-ELP-50 imobilizado na superfície do deslizamento de cobertura, adicione 15 microlitros de OaAEP1 na tampa e deixe incubar por 30 minutos. Use de 15 a 20 mililitros de tampão AFM para lavar quaisquer proteínas não redigidas. Adicione 100 microliters de protease TEV para cortar a unidade proteica no local de reconhecimento TEV por uma hora a 25 graus Celsius.
Em seguida, use 15 a 20 mililitros de tampão AFM para lavar proteínas residuais. Vincule a unidade de ligadura cohesin-T-L-protein de interest-NGL ao vidro GL-ubiquitin-NGL por OaAEP1 por 30 minutos. Dependendo das construções proteicas GL-ubiquitina-NGL a ser construída sobre a superfície do vidro, repita as etapas de preparação da poliproteína n1 vezes.
Omitir a última reação de decote TEV para reservar cohesina no polímero proteico como vidro cohesin-TEV-L-ubiquitin-n-NGL. Adicione um mililitro de tampão AFM com cloreto de cálcio de 10 milimilas e cinco milimões de ácido ascórbico à câmara de fluidos AFM. Escolha a ponta D da sonda AFM funcionalizada para o experimento.
Mergulhe a sonda no buffer AFM. Retraia o cantilever a uma velocidade constante de 400 nanômetros por segundo da superfície. Enquanto isso, registo a curva de extensão de força a uma taxa amostral de 4.000 hertz.
Use o teorema da equipartição para calibrar o cantilever no buffer AFM com um valor de K constante de mola preciso antes de cada experimento. Conecte a ponta cantilever funcionalizada com dockerina à superfície depositada de proteína funcionalizada com cohesina para formar o par cohesin-dockerin. Em seguida, abra o software de processamento de dados JPK e selecione a curva de extensão de força com o padrão característico semelhante ao dente de serra e uma força de desprendimento alta.
Neste estudo, os resíduos de GNL introduzidos entre proteínas adjacentes pela ligadura OaAEP1 não afetaram a estabilidade do monômero proteico no polímero expresso, pois a força desdobrada e o incremento do contra-comprimento foram comparáveis com o estudo anterior. A purificação da rubredoxina de forma férnica apresentou picos típicos de absorção visualizada UV em 495 nanômetros e 575 nanômetros, enquanto a forma de zinco não.
A mistura de ligadura GL-ubiquitin e cohesin-TEV-L-ubiquitin com ou sem OaAEP1 e OaAEP1 pura também são mostradas. É fundamental funcionalizar a superfície com Sulfo-SMCC ativo para fixação de peptídeo com sucesso. Aqui fornecemos um novo método para construir proteína polimerizada.
Facilita que os pesquisadores estudem um sistema proteico complexo usando espectroscopia de força de molécula única. O ácido cromado é fortemente corrosivo e ácido. Tenha cuidado ao prepará-lo e lidar com isso.
