השיטה האנזימטית שלנו משתמשת אוליגומר חלבון עם מספר מבוקר של תואר פילמיזציה. זוהי הכנת מדגם מושלמת למחקר ספקטרוסקופיה כוח מולקולה אחת, כמו גם בניית חומר מבוסס חלבון. השיטה שלנו אינה מציגה ציסטאין לחלבון היעד.
בגלל ציסטאין הוא אחד השאריות הפונקציונליות החשובות ביותר עבור חלבון, זה מקל על בניית חלבון חומר פולימרי או אנזימים. הדגמת ההליך תהיה יבינג דנג ושנגחאו שי, סטודנטים לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להמיס 20 גרם של כרומט אשלגן ב 40 מיליליטר של מים אולטרה רגליים בבקבוק.
מוסיפים לאט 360 מיליליטר של חומצה גופרתית מרוכזת לתופת dichromate אשלגן ולהשתמש מוט זכוכית לבחוש בעדינות. מניחים כיסוי בחומצה הכרומית ומעבירים לתנור ב 80 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. נקה את הכיסויים במים ולאחר מכן אלכוהול אתיל מוחלט וייבש את הכיסויים עם זרם של חנקן.
טבול לחלוטין את הכיסויים בנפח של 1% לפי נפח APTES פתרון טולואן למשך שעה בטמפרטורת החדר תוך הגנה עליהם מפני אור. לשטוף את הכיסוי עם טולואן הראשון ולאחר מכן עם אלכוהול אתיל מוחלט לייבש את הכיסוי עם זרם של חנקן. דגירה כיסוי ב 80 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות ולאחר מכן לתת לו להתקרר לטמפרטורת החדר.
השתמשו בפיפטה כדי להוסיף 200 מיקרוליטרים של מיליגרם אחד למיליליטר Sulfo-SMCC בתסרון DMSO בין שני כיסויים משותקים ודגירה למשך שעה מוגנת מפני אור. לאחר שעה, לשטוף את הכיסויים עם DMSO הראשון ולאחר מכן עם אלכוהול אתיל מוחלט כדי להסיר שאריות Sulfo-SMCC. יבש את הכיסוי תחת זרם של חנקן.
פיפטה 60 מיקרוליטר של 200 GL-ELP-50 מיקרומולרי פתרון חלבון ציסטה על כיסוי פונקציונלי דגירה ב 25 מעלות צלזיוס במשך כשלוש שעות. לאחר מכן, לשטוף את כיסוי עם מים אולטרה-חוץ כדי להסיר את GL-ELP-50-cys שלא נותק. כדי להכין משטח cantilever פונקציונלי, תחילה לטבול את cantilevers בחומצה כרומית ולנקות את cantilevers ב 80 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
השתמש במים ואלכוהול אתיל מוחלט לשטוף את החומצה. לטבול את cantilever עם 1% נפח לפי נפח APTES פתרון toluene לבצע מליחות אמינו במכסה צינור פלסטיק במשך שעה אחת. לשטוף את cantilever עם אלכוהול אתיל מוחלט ולאחר מכן לאפות את cantilever ב 80 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
לטבול את cantilever ב פתרון Sulfo-SMCC במשך שעה אחת ולאחר מכן לשטוף את cantilever עם אלכוהול אתיל מוחלט. כדי לקשר את cys-ELP-50-NGL אל פני השטח, לטבול את cantilevers ב cys-ELP-50-NGL עם הקבוצה maleimide של Sulfo-SMCC במשך 1.5 שעות. ואז לשטוף את cys-ELP-50-NGL לא ערוך על cantilever על ידי מים אולטרה חוץ.
לאחר מכן, לטבול cantilever פונקציונלי בתתא המכיל 200 microliters של 50 מיקרומולרי GL-CBM-XDockerin פתרון חלבון עם 200 nanomolar OaAEP1 ולמקם אותם ב 25 מעלות צלזיוס במשך 20 עד 30 דקות. לאחר מכן השתמשו במאגר AFM כדי לשטוף חלבון לא מופק. זה קריטי לשטוף חלבון שיורית לא מוצהר לפני ניסוי AFM כי זה יהיה ליצור זוגות מלוהסין-dockerin ואת הבלוק cantilever לקחת חלבון חדש על פני השטח.
כדי לקשר את יחידת הרצועות cohesin-T-L-חלבון של עניין-NGL כדי GL-ELP-50 משותק על משטח coverslip, להוסיף 15 microliters של OaAEP1 על coverslip ולתת לו דגירה במשך 30 דקות. השתמש 15 עד 20 מיליליטר של חיץ AFM לשטוף את כל החלבונים שלא נותק. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של פרוטאז TEV כדי לחשוף את יחידת החלבון באתר זיהוי TEV למשך שעה ב-25 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן השתמש 15 עד 20 מיליליטר של חיץ AFM לשטוף את החלבונים שיורית. לקשר את יחידת הרצועות cohesin-T-L-חלבון של עניין-NGL לזכוכית GL-ubiquitin-NGL על ידי OaAEP1 במשך 30 דקות. בהתאם לחלבון בונה GL-ubiquitin-NGL להיבנות על משטח הזכוכית, לחזור על צעדי הכנת פוליפרוטאין n1 פעמים.
השמט את תגובת המחשוף האחרונה של TEV כדי לשמור על לכידות על פולימר החלבון כזכוכית לכידות-TEV-L-ubiquitin-n-NGL. הוסף מיליליטר אחד של חיץ AFM עם 10 מילימולר סידן כלורי וחומצה אסקורבית מילימולרית לתא הנוזלים AFM. בחר את קצה ה- D של גשושית AFM המתפקדת עבור הניסוי.
לטבול את החללית במאגר AFM. נסיגה cantilever במהירות קבועה של 400 ננומטר לשנייה מפני השטח. בינתיים, תקליט את עקומת הארכת הכוח בקצב מדגם של 4,000 הרץ.
השתמשו במאורת האקוויפרטציה כדי לכייל את ה-cantilever במאגר AFM עם ערך K קבוע קפיץ מדויק לפני כל ניסוי. חבר את קצה cantilever פונקציונלי עם דוקרין למשטח המופקד חלבון פונקציונלי עם לכידות כדי ליצור את זוג מלוהסין-דוקרין. לאחר מכן פתחו את תוכנת עיבוד הנתונים JPK ובחרו עקומת הרחבת כוח עם התבנית האופיינית דמוית המסור וכוח ניתוק גבוה.
במחקר זה, שאריות NGL שהוכנסו בין חלבונים סמוכים על ידי קשירה OaAEP1 לא השפיעו על יציבות מונומר חלבון בפולימר לידי ביטוי ככוח המתפתח תוספת אורך קונטרה היה דומה עם מחקר קודם. הטיהור של רוברדוקסין בצורת ברזל הציג פסגות ספיגה טיפוסיות של UV ב-495 ננומטר ו-575 ננומטר ואילו צורת האבץ לא. תוצאות ג'ל SDS-page של עיכול צעד ו קשירה להראות מגולל TEV-L-ubiquitin, תערובת החלבון תוצאה של מחשוף TEV, טהור GFP-TEV-פרוטאז, מוצר מטוהר GL-ubiquitin.
תערובת קשירה GL-ubiquitin מקולקל ו לכידות-TEV-L-ubiquitin עם או בלי OaAEP1 ו OaAEP1 טהור מוצגים גם כן. זה קריטי כדי לתפקד את פני השטח עם פעיל Sulfo-SMCC עבור מצורף פפטיד בהצלחה. כאן אנו מספקים שיטה חדשה לבניית חלבון פולימרי.
זה מקל על החוקרים לחקור מערכת חלבון מורכבת באמצעות ספקטרוסקופיית כוח מולקולה אחת. חומצה כרומית היא מאוד מאכלת וחומצית. היזהר כשאתה מכין ומטפל בזה.
