هذه التقنية أكثر موثوقية وكفاءة ولا تتطلب ممارسة أو تدريبا مكثفا مقارنة بتقنيات أجهزة Langendorff الأكثر استخداما. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تحد من الوقت الإقفاري لأن التروية الأولية تحدث في الجسم الحي. أثناء تنفيذ هذه التقنية ، من الضروري تجنب الفقاعات في المشعب وتجنب الحركة المفرطة للقلب أثناء الهضم ، يمكن أن تقلل من الغلة.
ستوضح هذه التقنية سارة ستورجيل ، طالبة دراسات عليا في مختبر الدكتور مارك زيولو. ابدأ بتنظيف المشعب الذي يتم التحكم في درجة حرارته باستخدام مخزن التروية المحضر حديثا. للقيام بذلك ، قم بربط إبرة قياس 27 ومسح الفقاعات باستخدام موصل قفل luer.
تأكد من عدم بقاء فقاعات. لعزل عضلة القلب ، فضح عظم الفأر المخدر بالكامل ، والجانبي إلى خط الوسط ، وقطع بالقرب من الأضلاع والإبط. ثم قطع الحجاب الحاجز ، وضمان الجروح الضحلة لتجنب القلب.
المشبك القص مع مرقئ وطي الأضلاع للخلف لفضح التجويف الصدري. قم بإزالة التامور من القلب برفق قبل قطع الوريد الأجوف السفلي البعيد عن القلب مباشرة. احقن ثلاثة ملليلتر من محلول إزالة الثلج البارد في البطين الأيمن للقلب على مدار دقيقة واحدة باستخدام إبرة قياس 27.
بعد ذلك ، امسك القلب باستخدام الملقط. اسحبه بعيدا عن الجسم واكشف أكبر قدر ممكن من الشريان الأورطي. ثم المشبك الشريان الأورطي الصاعد باستخدام مرقئ واستئصال القلب.
انقل القلب المثبت بسرعة إلى غطاء طبق بتري من مادة البولي بروبيلين يحتوي على 10 ملليلتر من محلول التروية الدافئ. ضع القلب المثبت في المنصة الداعمة وحقن 10 ملليلتر من محلول التروية الذي يتم التحكم في درجة حرارته عند 37 درجة مئوية في البطين الأيسر على مدار خمس دقائق باستخدام إبرة قياس 27 مثبتة متصلة بالمشعب. بعد ذلك ، انقل القلب المثبت والمنصة الداعمة إلى طبق بتري مع ما يقرب من خمسة ملليلتر من محلول الهضم.
تبادل محاقن الإدخال لحقنة 50 ملليلتر تحتوي على 25 ملليلتر من الهضم العازلة. قم بإزالة المشعب من أي فقاعات ومخزن التروية المتبقي قبل الحقن. استبدل الإبرة بعناية في نفس موضع الإبرة في قمة البطين الأيسر.
بمساعدة مضخة التروية ، قم بحقن 37 درجة مئوية من محلول الهضم في البطين الأيسر لمدة 15 دقيقة باستخدام حقنة سعة 50 ملليلتر. تحكم في درجة حرارة المحلول باستخدام سترة مائية تمت معايرتها لإخراج محلول 37 درجة مئوية. أخرج البطينين من الأذينين قبل نقلهما إلى كأس زجاجية سعة 10 ملليلترات.
أضف ثلاثة ملليلترات من محلول الهضم إلى الدورق وقطع البطينين إلى قطع كبيرة باستخدام مقص حاد. غطي الدورق بورق الألمنيوم وضعيه في حمام مائي مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق قطع الأنسجة في ثلاثة ملليلتر من محلول الهضم وسحنها لمدة أربع دقائق تقريبا أو حتى يتم تحقيق خليط متجانس.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتصفية الخلايا في أنبوب بولي بروبيلين سعة 50 ملليلتر باستخدام مصفاة خلايا نايلون 70 ميكرومتر. اغسل مصفاة خلايا النايلون بثلاثة ملليلتر من محلول الهضم. أعد المرشح إلى أنبوب بولي بروبيلين دائري القاع سعة 14 ملليلتر وجهاز طرد مركزي.
تخلص من المادة الطافية قبل تعليق الحبيبات في ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت للتوقف. إلى تعليق الخلية ، أضف 54 ميكرولترا من مخزون كلوريد الكالسيوم 100 ملليمولار لجعل تركيز كلوريد الكالسيوم النهائي 1.8 مليمولار. دع الخلايا الحية تستقر لمدة 10 دقائق وقم بإزالة المادة الطافية التي تحتوي على خلايا ميتة.
بعد تعليق الحبيبات في محلول التخزين ، يمكن استخدام الخلايا للتجارب الوظيفية والثقافات. أظهرت صور مجهر برايتفيلد للخلايا المعزولة أن عزل خلايا عضلة القلب في الفئران أنتج خلايا هادئة على شكل قضيب بدون فقاعات غشائية أو حواف مستديرة. أظهرت الخلايا ما يقرب من 80 ٪ من العائد ومعدلات البقاء على قيد الحياة عالية تحدد نجاح تقنية العزل.
للعزل الناجح ، من المهم للغاية إزالة الفقاعات من المشعب وإدخال الإبرة في نفس الفتحة في القلب. بمجرد عزلها ، يمكن استخدام الخلايا العضلية القلبية للتجارب الوظيفية الخلوية والجزيئية.
