يستخدم هذا البروتوكول مجهر متعدد التصفية للتصوير الحي للهيكل الكامل لسطح العين الماوس في نموذج الماوس الفلوري المزدوج المعدلة وراثيا. إن الجمع بين منصة مجهرية متعددة الصور مخصصة وفئران ثنائية محورة وراثيا للفلورسنت تمكن من التصور في الوقت الحقيقي لسطح العين وبنيته. لإعداد المجهر متعدد الصور، حدد غمر الماء 20X، 1.00 NA الهدف وتعيين ليزر التيتانيوم الياقوت كمصدر الإثارة على المجهر تستقيم.
تعيين الطول الموجي خرج الليزر إلى 880 نانومتر لEGFP و 940 نانومتر ل tdTomato. وتشمل اثنين من المرايا dichroic لفصل SHG EGFP وGFP tdTomato واستخدام 434-17، 510-84 و 585-40 نانومتر تمرير الفرقة المرشحات لفصل الطيفي إشارات EGFP وSdTomato. لإعداد حامل العين ، بعد التأكد من عدم الاستجابة لدواسة منعكس في تخدير 8-12 ماوس من العمر أسبوع ، ضع الماوس على مرحلة المجهر ساخنة وإدراج مسبار مراقبة درجة الحرارة.
ضع الماوس في حامل فأر مجسم مخصص وأدخل قضبان الأذن في اللحم السمعي الخارجي. استخدام ثلاث نقاط التثبيت لتأمين حامل الرأس وتطبيق 0.4٪ هيدروكلوريد أوكسيبوكوكاين والمحلول الملحي على سطح العين. تغطية نصائح من زوج من عدد خمسة دومون ملقط مع حلقة أنبوب PE.
بعد ثلاث دقائق إجراء تراجع الجفن اليدوي لتأكيد نتوء مقلة العين ووضع بعناية حلقة أنبوب حامل PE على طول هامش الجفن لفضح سطح العين. واستخدام مقبض الباب من حامل لتحقيق الاستقرار في مقلة العين مع ملقط. ثم، تغطية سطح القرنية مع هلام العين مع مؤشر الانكسار من 1.338.
بالنسبة للتصوير التسلسلي Z لسطح القرنية، استخدم مصدر ضوء الزئبق لتصوير حقل الاستهداف وفتح برنامج المجهر. حدد مضاعف الصورة المناسبة والمكاسب الرقمية لتصور بنية الخلوية في سطح العين وتعيين الشريحة الأولى والأخيرة للسماح بالحصول على كومة صورة. تعيين دقة الصورة إلى 512 في 512 بكسل و خطوة Z إلى ميكرومتر واحد.
ثم انقر فوق ابدأ لجمع Z الصور التسلسلية الحصول على صورة حية واحدة مع 880 نانومتر الإثارة لجمع إشارة EGFP SHG، وصورة حية واحدة في 940 نانمتر الإثارة لجمع إشارة EGFP tdTomato داخل كل منطقة. في جميع أنحاء الصورة، استخدم حامل المرحلة السائرة الآلية لتدوير مقلة العين للسماح بالتصوير عبر سطح القرنية بأكمله. عندما تم الحصول على جميع الصور، قم بتحميل الصور التسلسلية Z في فيجي وحدد البرنامج المساعد Median 3D filter.
بعد إزالة الضوضاء الخلفية، حدد حزمة تصفية قناع unsharp فيجي لشحذ الصور وانقر على النقيض سطوع السيارات لتحسين جودة الصور تلقائيا. بعد المعالجة، حفظ الصور كتسلسل صورة تسلسلي وتصدير تسلسل الصورة إلى برنامج إعادة الإعمار 3D المناسبة. في جميع الصور المجهرية متعددة الصور، تقديم إشارات EGFP tdTomato و SHG باللونين الأخضر الزائف والأحمر السماوي على التوالي قبل التقاط صور الهيكل ثلاثي الأبعاد بواسطة لقطة.
يسمح المجهر متعدد الصور بالتصور من الجناح السطحي والخلايا القاعدية في ظهارة القرنية للفئران المعدلة وراثيا الفلورية المزدوجة. يمكن تعيين خلايا واحدة من الطبقة القاعدية إلى الطبقة السطحية وكذلك خلايا سطحية واحدة سداسية الشكل. كما كشفت عن ذلك التعبير السيتوبلازمي لإشارة tdTomato ، فإن نظام الغشاء الغني بالبروتين داخل الخلايا ، بما في ذلك جهاز golgi و endoplasmic الشبكية متناثر داخل الخلايا الجناحية.
ضمن ستروما collagenous، وترد على شكل ممتاز coratesites من قبل الغشاء استهداف الفلورسنتين EGFP في هذه الفئران. وcoratesites جزءا لا يتجزأ من ستروما الكلية هي أكثر متباعدة فضفاضة من داخل الخلايا البطانية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن يتصور الأعصاب المتفرعة رقيقة داخل ستروما القرنية من قبل غشاء استهداف إشارات tdTomato و monolays الخلايا البطانية القرنية تظهر شكل سداسية متجانسة نسبيا متصلة في نمط العسل.
يتكون ظهارة الـ Limbal من طبقة إلى طبقتين من الخلايا الظهارية. كما تمكن السلالة المعدلة وراثياً من الفلورسنت المزدوجة من تصوير الشعيرات الدموية داخل الملتحمة، مما يسهل إعادة بناء العمارة ثلاثية الأبعاد للريش الدموية التي تحدد بطانة الأوعية الدموية. استقرار مقلة العين مع الضغط المعتدل دون إصابة أمر بالغ الأهمية للحصول على صور ذات نوعية جيدة كما ضغط غير كاف أو المفرط يمكن أن يعرض للخطر جودة الصورة.
يمكن تعديل هذه المنصة تصوير الصور NVivo للتصور من الهياكل تحت سطح العين ويمكن تطبيقها على الدراسات في الموقع من مختلف الأمراض العيون.
