Bu protokol, çift floresan transgenik fare modelinde fare oküler yüzeyinin tüm yapısının canlı görüntülenmesi için çok filtreli bir mikroskop kullanır. Özel multifoton mikroskobik platform ve çift floresan transgenik farelerin birleşimi, göz yüzeyinin ve yapısının gerçek zamanlı olarak görüntülenmesine olanak sağlar. Multifoton mikroskobu kurmak için, su daldırma 20X, 1.00 NA hedefi seçin ve dik bir mikroskop üzerinde uyarma kaynağı olarak Titanyum Safir lazer ayarlayın.
Lazer çıkış dalga boyunu EGFP için 880 nanometreye, tdTomato için 940 nanometreye ayarlayın. SHG EGFP ve EGFP tdTomato ayrımı için iki dikroik ayna ekleyin ve 434-17, 510-84 ve 585-40 nanometre bant geçiş filtreleri kullanmak spectrally SHG EGFP ve tDTomato sinyalleri ayırmak için filtreler. Göz tutucuyu kurmak için, anestezili 8-12 haftalık farede pedal refleksine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra fareyi ısıtılan mikroskop aşamasına yerleştirin ve bir sıcaklık izleme probu yerleştirin.
Fareyi özel stereotaksik fare tutucuya yerleştirin ve harici işitsel meatus'a kulak çubukları takın. Baş tutucuyu sabitlemek ve göz yüzeyine %0,4 Oxybuprocaine Hidroklorür ve tuzlu çözelti uygulamak için üç nokta lı fiksasyon kullanın. PE tüp döngü ile beş numaralı Dumont forceps bir çift uçlarını kapatın.
Üç dakika sonra göz küresi çıkıntısını doğrulamak için manuel göz kapağı geri çekilmesi gerçekleştirin ve göz kapağı marjı boyunca oküler yüzeyi ortaya çıkarmak için dikkatlice bir PE tutucu tüp halkayerleştirin. Ve forceps ile göz küresi stabilize etmek için tutucunun topu kullanın. Daha sonra kornea yüzeyini 1.338 kırılma indisi ile bir göz jeli ile kapatın.
Kornea yüzeyinin Z seri görüntülemesi için, hedefleme alanını görüntülemek ve mikroskop yazılımını açmak için cıvalı bir ışık kaynağı kullanın. Oküler yüzeydeki hücresel yapıyı görselleştirmek için uygun fotoğraf çarpanını ve dijital kazanımları seçin ve görüntü yığınının edinimi için ilk ve son slaytı ayarlayın. Görüntü çözünürlüğünü 512'ye 512 piksel, Z adımını ise bir mikrometreye ayarlayın.
Daha sonra, SHG EGFP sinyal koleksiyonu için 880 nanometre uyarma ile bir canlı görüntü elde Z seri görüntüleri toplamak için başlat'ı tıklatın ve her alanda EGFP tdTomato sinyal toplama için 940 nanometre uyarma bir canlı görüntü. Görüntü boyunca, tüm kornea yüzeyinde görüntüleme ye izin vermek için göz küresini döndürmek için step motorlu sahne tutucuyu kullanın. Tüm görüntüler elde edildiğinde, Z seri görüntülerini Fiji'ye yükleyin ve Ortanca 3D filtre eklentisini seçin.
Arka plan gürültüsünü çıkardıktan sonra, görüntüleri keskinleştirmek için keskinleştirme maskesi filtresi paketi Fiji'yi seçin ve görüntülerin kalitesini otomatik olarak optimize etmek için otomatik parlaklık kontrastını tıklatın. İşlemden sonra, görüntüleri seri görüntü dizisi olarak kaydedin ve görüntü dizisini uygun bir 3D yeniden yapılandırma yazılımı programına aktarın. Tüm multifoton mikroskopi görüntülerinde, 3D yapı görüntülerini anlık görüntüyle yakalamadan önce egfp tdTomato ve SHG sinyallerini sırasıyla sözde yeşil, kırmızı ve zil şeklinde sunar.
Multifoton mikroskopi, çift floresan transgenik farelerin kornea epitelindeki yüzeysel Kanat ve Bazal hücrelerinin görüntülenmesine olanak sağlar. Bazal tabakadan tek hücreler yüzeysel tabaka yanı sıra tek altıgen şekilli yüzeysel hücrelereşlenebilir. TdTomato sinyalinin sitoplazmik ekspresyonu ile ortaya çıktığı gibi, golgi aparatı ve endoplazmik retikulum da dahil olmak üzere membran proteini zengin hücre içi vesiküler sistem kanat hücrelerinin içine dağılmış durumdadır.
Kollajen stroma içinde, stellat şekilli coratesites bu farelerde EGFP floresan hedefleyen membran tarafından özetlenmiştir. Kolej stroma gömülü coratesites daha gevşek endotel hücrelerinin içinde daha aralıklı. Buna ek olarak, kornea stroma içinde ince dallanma sinirler de membran tdTomato sinyalleri ve korneal endotel hücre monolayers hedefleyen tarafından görselleştirilmiş olabilir nispeten homojen altıgen şekil petekli desen bağlı göstermektedir.
Limbal epitel epitel epitel hücrelerinin bir ila iki tabakaoluşur. Çift floresan muhabir transgenik suşu da konjonktiva içinde kılcal damarların görüntülenmesi sağlar, vasküler endotel özetleyen kılcal damarların 3D mimarisinin rekonstrüksiyonu kolaylaştıran. Yetersiz veya aşırı basınç görüntü kalitesini bozabilir gibi yaralanma olmadan orta basınç ile göz küresi stabilize etmek kaliteli görüntüler elde etmek için önemlidir.
Bu NVivo görüntü görüntüleme platformu oküler yüzey altında yapıların görselleştirilmesi için değiştirilebilir ve çeşitli oftalmik hastalıkların yerinde çalışmalara uygulanabilir.
