Этот протокол использует мультифильтрный микроскоп для живой визуализации всей структуры глазной поверхности мыши в двойной флуоресцентной трансгенной модели мыши. Сочетание пользовательской многофотонной микроскопической платформы и двойных флуоресцентных трансгенных мышей позволяет в режиме реального времени визуализировать и структуру глазной поверхности. Чтобы настроить мультифотонный микроскоп, выберите погружение в воду 20X, 1.00 NA цели и установить титан сапфировый лазер в качестве источника возбуждения на вертикальном микроскопе.
Установите длину волны лазерного выхода до 880 нанометров для EGFP и 940 нанометров для tdTomato. Включите два дихроических зеркала для разделения SHG EGFP и EGFP tdTomato и используйте 434-17, 510-84 и 585-40 нанометров диапазон пройти фильтры спектрально отделить сигналы SHG EGFP и tdTomato. Чтобы настроить держатель глаза, после подтверждения отсутствия реакции на педаль рефлекс в анестезии 8-12 недель мыши, поместите мышь на стадии подогревом микроскопа и вставить зонд мониторинга температуры.
Поместите мышь в пользовательский стереотаксис держателя мыши и вставьте ухо баров во внешний слуховой meatus. Используйте трехточечную фиксацию, чтобы обеспечить держатель головы и применить 0,4%Oxybuprocaine гидрохлорид и солевой раствор на глазной поверхности. Обложка советы пару номер пять Dumont типпы с PE трубки петли.
После трех минут выполнить ручное опровержение век, чтобы подтвердить выступ глазного яблока и тщательно место PE держатель трубки петли вдоль края век, чтобы разоблачить глазной поверхности. И использовать ручку держателя, чтобы стабилизировать глазное яблоко с типсами. Затем накройте поверхность роговицы гелем для глаз с рефракционным индексом 1.338.
Для последовательной визуализации поверхности роговицы используйте источник ртутного света для изображения поля таргетинга и открытия программного обеспечения микроскопа. Выберите соответствующий множитель фотографий и цифровые выгоды для визуализации клеточной структуры на глазной поверхности и установите первый и последний слайд, чтобы обеспечить приобретение стека изображений. Установите разрешение изображения до 512 на 512 пикселей и шаг к одному микрометру.
Затем нажмите, начните собирать серийные изображения, приобретая одно живое изображение с 880 нанометровой возбуждением для сбора сигналов SHG EGFP, и одно живое изображение на 940 нанометровом возбуждении для сбора сигналов EGFP tdTomato в каждой области. На протяжении всего изображения, использовать stepper моторизованных держатель сцены, чтобы повернуть глазное яблоко, чтобы изображения по всей поверхности роговицы. Когда все изображения были приобретены, загрузите серийные изображения на Фиджи и выберите плагин медианного 3D-фильтра.
После удаления фонового шума, выберите нерезкой маски фильтр пакет Фиджи, чтобы заточить изображения и нажмите авто яркость контраста автоматически оптимизировать качество изображений. После обработки сохраните изображения в качестве последовательности серийных изображений и экспортировать последовательность изображений в соответствующую программу 3D-реконструкции. На всех многофотонных микроскопиях изображения представляют сигналы EGFP tdTomato и SHG в псевдозеленых, красных и цианов, соответственно, перед захватом изображений 3D-структуры моментальным снимком.
Мультифотонная микроскопия позволяет визуализировать поверхностное крыло и базальные клетки в эпителии роговицы двойных флуоресцентных трансгенных мышей. Одиночные клетки из базального слоя могут быть отображены на поверхностный слой, а также одиночные шестиугольные поверхностные клетки. Как показала цитоплазмическая экспрессия сигнала tdTomato, мембранный белок, богатый внутриклеточной везикулярной системой, включая аппарат голги и эндоплазмический цитикулум, рассеивается внутри клеток крыла.
В коллагеновой строме, stellate формы coratesites изложены мембраны ориентации EGFP флуоресцентные лампы у этих мышей. Кораиты, встроенные в строму колледжа, более свободно размечены, чем в эндотелиальных клетках. Кроме того, тонкие ветвясь нервы в роговицы стромы также могут быть визуализированы мембраны ориентации tdTomato сигналов и роговицы эндотелиальных клеток монослой продемонстрировать относительно однородной шестиугольной формы связаны в сотовый узор.
Лимбальный эпителий состоит из одного-двух слоев эпителиальных клеток. Двойной флуоресцентный репортер трансгенного штамма также позволяет изображения капилляров в конъюнктиве, облегчая реконструкцию 3D архитектуры капилляров с изложением сосудистого эндотелия. Стабилизация глазного яблока с умеренным давлением без травм имеет решающее значение для получения изображений хорошего качества, так как недостаточное или чрезмерное давление может поставить под угрозу качество изображения.
Эта платформа визуализации изображений NVivo может быть изменена для визуализации структур под глазной поверхностью и может быть применена к исследованиям различных офтальмологических заболеваний на месте.
