Questo protocollo utilizza un microscopio multifiltro per l'imaging dal vivo dell'intera struttura della superficie oculare del mouse nel modello a doppio mouse transgenico fluorescente. La combinazione di una piattaforma microscopica multifotona personalizzata e di due topi transgenici fluorescenti consente la visualizzazione in tempo reale della e della struttura della superficie oculare. Per impostare il microscopio multifotono, selezionare l'obiettivo 20X, 1.00 NA di immersione in acqua e impostare il laser Titanium Sapphire come fonte di eccitazione su un microscopio verticale.
Impostare la lunghezza d'onda di uscita laser su 880 nanometri per EGFP e 940 nanometri per tdTomato. Includere due specchi dicroici per la separazione di SHG EGFP e EGFP tdTomato e utilizzare filtri passa banda 434-17, 510-84 e 585-40 nanometri per separare spettralmente i segnali SHG EGFP e tdTomato. Per impostare il supporto per gli occhi, dopo aver confermato la mancanza di risposta al riflesso del pedale in un mouse anestetizzato di 8-12 settimane, posizionare il mouse sullo stadio del microscopio riscaldato e inserire una sonda di monitoraggio della temperatura.
Posizionare il mouse in un supporto stereotassico personalizzato per mouse e inserire le barre dell'orecchio nel meato uditivo esterno. Utilizzare la fissazione a tre punti per fissare il supporto della testa e applicare una soluzione ossibuprocaina 0,4% cloridrato e salina sulla superficie oculare. Coprire le punte di una coppia di forcep Dumont numero cinque con l'anello del tubo in PE.
Dopo tre minuti eseguire una retrazione manuale delle palpebre per confermare la sporgenza del bulbo oculare e posizionare con cura un anello del tubo porta-PE lungo il margine della palpebra per esporre la superficie oculare. E utilizzare la manopola del supporto per stabilizzare il bulbo oculare con le forcep. Quindi, coprire la superficie corneale con un gel per gli occhi con un indice di rifrazione di 1,338.
Per l'imaging seriale Z della superficie corneale, utilizzare una sorgente luminosa al mercurio per immaginare il campo di targeting e aprire il software del microscopio. Selezionare il moltiplicatore di foto e i guadagni digitali appropriati per visualizzare la struttura cellulare nella superficie oculare e impostare la prima e l'ultima diapositiva per consentire l'acquisizione di uno stack di immagini. Impostare la risoluzione dell'immagine su 512 per 512 pixel e il passaggio Z su un micrometro.
Quindi, fai clic per raccogliere immagini seriali Z acquisendo un'immagine dal vivo con un'eccitazione di 880 nanometri per la raccolta del segnale SHG EGFP e un'immagine dal vivo con un'eccitazione di 940 nanometri per la raccolta del segnale TdTomato EGFP all'interno di ogni area. In tutta l'immagine, utilizzare il supporto motorizzato stepper per ruotare il bulbo oculare per consentire l'imaging su tutta la superficie corneale. Una volta acquisite tutte le immagini, caricare le immagini seriali Z nelle Fiji e selezionare il plug-in filtro 3D mediano.
Dopo aver rimosso il rumore di fondo, selezionate il pacchetto di filtri maschera di contrasto Fiji per affilare le immagini e fate clic sul contrasto automatico della luminosità per ottimizzare automaticamente la qualità delle immagini. Dopo l'elaborazione, salvare le immagini come sequenza di immagini seriali ed esportare la sequenza di immagini in un programma software di ricostruzione 3D appropriato. In tutte le immagini di microscopia multifotono, presenta i segnali EGFP tdTomato e SHG rispettivamente in pseudo verde, rosso e ciano prima di catturare le immagini della struttura 3D per istantanea.
La microscopia multifotonico consente la visualizzazione di cellule superficiali alare e basali nell'epitelio corneale di due topi transgenici fluorescenti. Le singole cellule dello strato basale possono essere mappate allo strato superficiale e singole cellule superficiali a forma esagonale. Come rivelato dall'espressione citoplasmatica del segnale tdTomato, il sistema vescicolare intracellulare ricco di proteine di membrana, incluso l'apparato golgi e il reticolo endoplasmatico, è sparso all'interno delle cellule ali.
All'interno dello stroma collagenoso, le casse a forma di stellato sono delineate dalla membrana che prende di mira i fluorescenti EGFP in questi topi. I coratesite incorporati nello stroma collegen sono più vagamente distanziati che all'interno delle cellule endoteliali. Inoltre, sottili nervi ramificati all'interno dello stroma corneale possono anche essere visualizzati con la membrana che prende di mira i segnali tdTomato e i monostrati di cellule endoteliali corneali dimostrano una forma esagonale relativamente omogenea collegata in un modello a nido d'ape.
L'epitelio limbale è costituito da uno o due strati di cellule epiteliali. Il doppio ceppo transgenico reporter fluorescente consente anche l'imaging dei capillari all'interno della congiuntiva, facilitando la ricostruzione dell'architettura 3D dei capillari che delineano l'endotelio vascolare. Stabilizzare il bulbo oculare con una pressione moderata senza lesioni è fondamentale per acquisire immagini di buona qualità in quanto una pressione insufficiente o eccessiva può compromettere la qualità dell'immagine.
Questa piattaforma di imaging di immagini NVivo può essere modificata per la visualizzazione di strutture sotto la superficie oculare e può essere applicata a studi in situ di varie malattie oftalmiche.
