Dieses Protokoll verwendet ein Multifiltermikroskop zur Live-Bildgebung der gesamten Struktur der Maus-Augenoberfläche im dualen fluoreszierenden transgenen Mausmodell. Die Kombination aus einer benutzerdefinierten mikroskopischen Multiphotonen-Plattform und zwei fluoreszierenden transgenen Mäusen ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung der Augenoberfläche und-Struktur. Um das Multiphotonenmikroskop einzurichten, wählen Sie das Wassertauchtsion 20X, 1.00 NA Objektiv und setzen Sie den Titan Sapphire Laser als Anregungsquelle auf einem aufrechten Mikroskop.
Stellen Sie die Laserausgangswellenlänge auf 880 Nanometer für EGFP und 940 Nanometer für tdTomato ein. Schließen Sie zwei dichroitische Spiegel für die Trennung von SHG EGFP und EGFP tdTomato ein und verwenden Sie 434-17, 510-84 und 585-40 Nanometer Bandpassfilter, um die SHG EGFP- und tdTomato-Signale spektral zu trennen. Um den Augenhalter einzurichten, nachdem Sie eine mangelnde Reaktion auf Pedalreflex eisern in einer anästhesierten 8-12 Wochen alten Maus bestätigt haben, legen Sie die Maus auf die beheizte Mikroskopstufe und setzen Sie eine Temperaturüberwachungssonde ein.
Legen Sie die Maus in einen benutzerdefinierten stereotaxic Maushalter und legen Sie Ohrstangen in die externe auditive Fleisch. Verwenden Sie Dreipunktfixierung, um den Kopfhalter zu sichern und eine 0,4%Oxybuprocain-Hydrochlorid- und Salzlösung auf die Augenoberfläche aufzutragen. Bedecken Sie die Spitzen eines Paares von Nummer fünf Dumont Zangen mit der PE-Rohrschleife.
Führen Sie nach drei Minuten eine manuelle Augenlid-Retraktion durch, um den Augapfelvorsprung zu bestätigen, und legen Sie vorsichtig eine PE-Halterrohrschlaufe am Augenlidrand entlang, um die Augenoberfläche freizulegen. Und verwenden Sie den Knopf des Halters, um den Augapfel mit der Zange zu stabilisieren. Bedecken Sie dann die Hornhautoberfläche mit einem Augengel mit einem Brechungsindex von 1,338.
Verwenden Sie für die serielle Z-Bildgebung der Hornhautoberfläche eine Quecksilberlichtquelle, um das Zielfeld abzubilden und die Mikroskopsoftware zu öffnen. Wählen Sie den passenden Fotomultiplikator und die digitalen Gewinne für die Visualisierung der Zellstruktur in der Augenoberfläche aus, und legen Sie die erste und letzte Folie fest, um die Erfassung eines Bildstapels zu ermöglichen. Stellen Sie die Bildauflösung auf 512 x 512 Pixel und der Z-Schritt auf ein Mikrometer ein.
Klicken Sie dann auf Starten, um Z-Serienbilder zu sammeln, die ein Live-Bild mit einer 880-Nanometer-Erregung für die SHG EGFP-Signalsammlung und ein Livebild bei einer 940-Nanometer-Erregung für die EGFP tdTomato-Signalsammlung in jedem Bereich aufnehmen. Verwenden Sie im gesamten Bild den motorisierten Schritthalter, um den Augapfel zu drehen, um eine Bildgebung über die gesamte Hornhautoberfläche zu ermöglichen. Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, laden Sie die seriellen Z-Bilder in Fidschi und wählen Sie das Median 3D-Filter-Plugin.
Nachdem Sie das Hintergrundrauschen entfernt haben, wählen Sie das unscharfe Maskenfilterpaket Fidschi aus, um die Bilder zu schärfen, und klicken Sie auf den automatischen Helligkeitskontrast, um die Bildqualität automatisch zu optimieren. Speichern Sie die Bilder nach der Verarbeitung als serielle Bildsequenz und exportieren Sie die Bildsequenz in ein entsprechendes 3D-Rekonstruktionssoftwareprogramm. Präsentieren Sie in allen Multiphotonenmikroskopiebildern die EGFP tdTomato- und SHG-Signale in Pseudogrün, Rot und Cyan, bevor Sie die 3D-Strukturbilder per Snapshot erfassen.
Die Multiphotonenmikroskopie ermöglicht die Visualisierung oberflächlicher Flügel- und Basalzellen im Hornhautepithel von zwei fluoreszierenden transgenen Mäusen. Einzelne Zellen aus der Basalschicht können der oberflächlichen Schicht zugeordnet werden sowie einzelne sechseckige oberflächliche Zellen. Wie sich aus der zytoplasmatischen Expression des tdTomato-Signals ergibt, ist das membranproteinreiche intrazelluläre vesikuläre System, einschließlich des Golgi-Apparates und endoplasmatisches Retikulum, in den Flügelzellen verstreut.
Innerhalb des kollagenen Stroms werden die stellatenförmigen Korateriten durch die Membran skizziert, die auf EGFP-Leuchtstoffröhren bei diesen Mäusen abzielt. Die in den Collegen stroma eingebetteten Coratesites sind lockerer als innerhalb der Endothelzellen. Darüber hinaus können dünne Verzweigungsnerven innerhalb des Hornhautstroms auch durch Membran-Targeting von tdTomato-Signalen visualisiert werden und horneale Endothelzellmonolayer zeigen eine relativ homogene sechseckige Form, die in einem Wabenmuster verbunden ist.
Das Limbalepithel besteht aus ein bis zwei Schichten epitheliale Zellen. Der doppelfluoreszierende Reporter-Transgenstamm ermöglicht auch die Abbildung von Kapillaren innerhalb der Bindehaut und erleichtert die Rekonstruktion der 3D-Architektur der Kapillaren, die das vaskuläre Endothel umreißt. Die Stabilisierung des Augapfels mit mäßigem Druck ohne Verletzungen ist entscheidend für den Erwerb von qualitativ hochwertigen Bildern, da unzureichender oder übermäßiger Druck die Bildqualität beeinträchtigen kann.
Diese NVivo Bildbildplattform kann zur Visualisierung von Strukturen unter der Augenoberfläche modifiziert und auf In-situ-Studien verschiedener ophthalmologischer Erkrankungen angewendet werden.
