تسمح هذه الطريقة الكيميائية الحيوية لتحديد حالة الغشاء أي بروتين غشاء أعرب عنه في الدماغ الذي يتوفر له جسم مضاد مناسب. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تتطلب تنقية تقارب وبدلا من ذلك يستخدم التغييرات في تنقل هلام لتحديد عدد التعديلات من البروتين من الفائدة. بعد تشريح الدماغ ، التجانس على الفور في 10 ملليلتر من العازلة التجانس في التجانس الزجاج على الجليد.
باستخدام ما يقرب من 12 السكتات الدماغية، والطرد المركزي lysates لمدة 15 دقيقة في 1400 مرة G، وأربع درجات مئوية. نقل المُنَتَكّل إلى أنبوب جديد على الجليد. إعادة بناء بيليه في 10 ملليلتر من العازلة التجانس.
التجانس عليه باستخدام ما يقرب من ستة السكتات الدماغية. الطرد المركزي تعليق في 710 مرات G وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. الجمع بين عظمى والطرد المركزي لهم في 40،000 مرات G وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
تجاهل supernatant وإعادة فرض جزء الغشاء بيليه في عازلة التجانس عن طريق كسر بيليه مع طرف ماصة و pipetting صعودا وهبوطا. إجراء فحص ABCA إلى كمية مستويات البروتين. لأداء مقايسة APEGS، ضع 470 ميكرولترات من المخزن المؤقت A في أنبوب 1.5 ملليلتر وأضف ما يقرب من 100 إلى 200 ملليغرام من البروتين.
سونيكات الأنبوب ومن ثم فصل البروتين غير قابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي للأنبوب في 25 درجة مئوية والحد الأدنى من 13،000 مرات G لمدة 10 دقائق. نقل البروتين solubalized إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر. أولاً، تعطيل روابط التخليد عن طريق احتضان البروتين المُزَوَّل في 25 ميكرولترات من TCEP لمدة 60 دقيقة عند 55 درجة مئوية.
ثم، كتلة cysteines الحرة عن طريق احتضان الحل مع 12.5 ميكرولترات من محلول الأسهم من NEM لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة. المقبل، تبدأ عملية هطول الأمطار الميثانول الكلوروفورم. نقل محلول البروتين من أنبوب 1.5 ملليلتر إلى أنبوب بولي بروبلين أو زجاج التي يمكن أن تكون طردية في دوار دلو يتأرجح بسرعة متواضعة.
إضافة مليلترين من الميثانول ودوة قصيرة. إضافة ملليلتر واحد من الكلوروفورم ودوامة لفترة وجيزة. ثم إضافة 1.5 ملليلتر من المياه الأيونة ودوامة لفترة وجيزة مرة أخرى.
إذا لزم الأمر، عكس أنبوب لضمان خلط دقيق. أجهزة الطرد المركزي العينات في 3000 مرة G و 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الدوار دلو يتأرجح. إزالة بعناية وتجاهل المرحلة العليا من الحل في أنبوب.
إضافة 1.5 ملليلتر من الميثانول. مزيج بلطف ولكن بدقة عن طريق عكس لطيف من الأنبوب، مع الحرص على عدم تجزئة فطيرة البروتين مبهمة. الطرد المركزي العينة في 3000 مرة G و 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في الدوار دلو يتأرجح.
باستخدام ماصة المصلية الزجاجية، وإزالة أكبر قدر من المرحلة العليا من الحل ممكن دون إزعاج فطيرة البروتين. شطف بعناية بيليه مع ملليلتر واحد من الميثانول والسماح لها للهواء الجاف لمدة 10 دقائق على الأقل. مع هطول الأمطار الكلوروفورم كاملة، تبدأ انشقاق من وصلات ثيريستر بالمتيل من خلال resuspending البروتين يترسب في 125 ميكرولترات من المخزن المؤقت A.Transfer إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر.
سونيكات أنبوب لفترة وجيزة ومن ثم الطرد المركزي في 13، 000 مرات G أو أعلى و 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإزالة المواد غير قابلة للذوبان. نقل البروتين solubalized إلى أنابيب جديدة 1.5 ملليلتر وإضافة 375 ميكرولترات من H العازلة أو العازلة T.After احتضان العينات لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وتكرار هطول الأمطار الميثانول الكلوروفورم. لإضافة m-PEG إلى cysteines غير المحمية، تبدأ من خلال إعادة بناء بيليه في 100 ميكرولترات من العازلة A التي تحتوي على 10 مل أو أكثر TCEP.
ثم نقل التعليق إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. إضافة 25 ميكروليتر من الأسهم m-PEG 5K الحل ومزيج عن طريق الأنابيب. احتضان في درجة حرارة الغرفة مع نهاية على نهاية التناوب.
بعد 60 دقيقة من الحضانة، وإزالة غير مدمج m-PEG 5K عن طريق أداء الأمطار الميثانول الكلوروفورم مرة أخرى. أجهزة الطرد المركزي في أكثر من 13،000 مرة G و 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. إزالة بعناية المرحلة العليا كما كان من قبل، وتجنب سميكة، فطيرة flocculent.
إضافة ملليلتر واحد من الميثانول ويخلط بلطف ولكن بدقة. أجهزة الطرد المركزي في أكثر من 13،000 مرة G و 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. إزالة بعناية طفح وشطف بيليه مع ملليلتر واحد من الميثانول.
مرة أخرى، أجهزة الطرد المركزي في أكثر من 13،000 مرة G و 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد تجفيف الهواء بيليه، resuspend في 50 ميكرولترات من العازلة A دون TCEP أو أي وكيل الحد. احتياطي 5 ميكرولترات من الحل لكمية البروتين BCA.
بعد الكمية، إضافة كمية مناسبة من 4x Laemmli عينة المخزن المؤقت. قم بتحميل العينة على هلام صفحة SDS. استخدام معيار فصل نقل وكشف بروتوكولات لنشاف الغربية.
للتحقيق في حالة النخيل من بروتينات SynDIG، تعرضت كسور غشاء P2 من أدمغة الماوس المتجانسة لمقايسة APEGS. الفصل والتسبر مع الأجسام المضادة أظهرت أن SynDIG1، SynDIG4 Prrt1، وPrrt2 هي palmitoylated في الدماغ الماوس. والغرض من ترسيب الميثانول الكلوروفورم هو منع مادة كيميائية واحدة، مثل النُهُو، من التدخل في الخطوة التالية من البروتوكول.
وترسب الميثانول الكلوروفورم السليم يزيل المواد الكيميائية غير المرغوب فيها مع تقليل فقدان البروتين. يمكن تطبيق هذه الطريقة على lysates الدماغ من الفئران من مختلف الأعمار أو من مناطق الدماغ المختلفة للتحقيق في اللوائح المكانية والزمانية من palmitoylation.
