Этот биохимический метод позволяет определить состояние пальмитоилирования любого мембранного белка, выраженного в головном мозге, для которого имеется подходящее антитело. Основным преимуществом этой техники является то, что она не требует сродства очистки и вместо этого использует изменения в мобильности геля, чтобы определить количество модификаций белка интереса. После вскрытия мозга, гомогенизировать его сразу в 10 миллилитров буфера гомогенизации в стеклянном гомогенизаторе на льду.
Используя приблизительно 12 ударов, центрифуга лисаты в течение 15 минут при 1400 раз G, и четыре градуса по Цельсию. Перенесите супернатант в новую трубку на льду. Переусердуйте гранулы в 10 миллилитров буфера гомогенизации.
Гомогенизировать его с помощью примерно шести ударов. Центрифуга подвески в 710 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут. Комбинат supernatants и центрифуги их на 40000 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение 20 минут.
Отбросьте супернатант и повторно потекуйте гранулированную мембранную фракцию в буфере гомогенизации, разбив гранулы кончиком пипетки и трубя вверх и вниз. Выполните анализ ABCA для количественного уровня белка. Для выполнения анализа APEGS поместите 470 микролитров буфера А в 1,5 миллилитровую трубку и добавьте от 100 до 200 миллиграммов белка.
Sonicate трубки, а затем отделить нерастворимый белок путем центрифугирования трубки при 25 градусов по Цельсию и как минимум 13000 раз G в течение 10 минут. Перенесите солубализованный белок в новую 1,5 миллилитровую трубку. Во-первых, нарушить дисульфидные связи путем инкубации solubalized белка в 25 микролитров TCEP в течение 60 минут при 55 градусов по Цельсию.
Затем блокируйте свободные цистеин, инкубируя раствор 12,5 микролитров запасного раствора NEM в течение трех часов при комнатной температуре. Далее начинается процесс выпадения хлороформных метанолов. Перенесите белковый раствор из 1,5 миллилитровой трубки в полипропиленовую или стеклянную трубку, которую можно центрифугировать в качающихся роторах ведра со скромной скоростью.
Добавьте два миллилитров метанола и вихря кратко. Добавьте один миллилитр хлороформа и вихря кратко. Затем добавьте 1,5 миллилитров деионизированной воды и вихря кратко снова.
При необходимости переверните трубку, чтобы обеспечить тщательное смешивание. Центрифуга образцов в 3000 раз G и 25 градусов по Цельсию в течение 30 минут в размахивая ротором ведра. Аккуратно удалите и отбросьте верхнюю фазу раствора в трубку.
Добавьте 1,5 миллилитров метанола. Смешайте мягко, но тщательно нежной инверсии трубки, будьте осторожны, чтобы не фрагмент непрозрачный блин белка. Центрифуга образца в 3000 раз G и 25 градусов по Цельсию в течение 10 минут в размахивая ротором ведра.
Используя стеклянную серологическую пипетку, удалите как можно больше верхней фазы раствора, не нарушая белковый блин. Тщательно промойте гранулы одним миллилитром метанола и дайте ему высохнуть в течение не менее 10 минут. С хлороформного метанола осадков завершена, начать расщепление palmitoyl thioester связей путем повторного перерасхода белка осадок в 125 микролитров буфера A.Transfer в новую трубку 1,5 миллилитров.
Sonicate трубки кратко, а затем центрифуги его в 13000 раз G или выше и 25 градусов по Цельсию в течение 10 минут, чтобы удалить нерастворимый материал. Перенесите солубализованный белок в новые 1,5 миллилитровые трубки и добавьте 375 микролитров буфера H или буфера T.После инкубации образцов в течение 60 минут при комнатной температуре повторите выпадение хлороформного метанола. Чтобы добавить m-PEG к незащищенным цистеям, начните с повторного перерасхода гранул в 100 микролитров буфера А, содержащих 10 миль или более TCEP.
Затем перенесите подвеску на 1,5 миллилитровую трубку. Добавьте 25 микролитров раствора m-PEG 5K и перемешайте с помощью труб. Инкубировать при комнатной температуре с конца над концом вращения.
После 60 минут инкубации, удалить неинкорпорированных м-ПЕГ 5K, выполняя хлороформ метанол осадков снова. Центрифуга при более чем 13 000 раз G и 25 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Аккуратно удалите верхнюю фазу, как и прежде, избегая густого, флоккульного блинчика.
Добавьте один миллилитр метанола и смешайте осторожно, но тщательно. Центрифуга при более чем 13 000 раз G и 25 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Аккуратно удалите супернатант и промойте гранулы одним миллилитром метанола.
Опять же, центрифуга на более чем 13000 раз G и 25 градусов по Цельсию в течение 10 минут. После высыхания воздуха гранулы, повторно помыть его в 50 микролитров буфера без TCEP или любого уменьшая агента. Зарезервировать 5 микролитров раствора для количественной оценки белка BCA.
После количественной оценки добавьте соответствующее количество буфера образца Laemmli 4x. Загрузите образец на гель страницы SDS. Используйте стандартные протоколы передачи и обнаружения разделения для западного blotting.
Для исследования состояния пальмитоилляции белков SynDIG мембранные фракции P2 из гомогенизированных мозгов мышей подверглись анализу APEGS. Разделение и зондирование с антителами показали, что SynDIG1, SynDIG4 Prrt1 и Prrt2 ладонью в мозге мыши. Цель осадков хлороформного метанола состоит в том, чтобы предотвратить одно химическое вещество, такое как NEM, мешая следующему шагу протокола.
Надлежащее количество хлороформного метанола приведет к удалению нежелательных химических веществ при минимизации потери белка. Этот метод может быть применен к лизитам мозга от мышей разных возрастов или из разных областей мозга, чтобы исследовать пространственно-временные правила palmitoylation.
