Este método bioquímico permite a determinação do estado de palmitoylation de qualquer proteína de membrana expressa no cérebro para a qual um anticorpo adequado está disponível. A principal vantagem dessa técnica é que ela não requer purificação de afinidade e, em vez disso, utiliza mudanças na mobilidade do gel para determinar o número de modificações de uma proteína de interesse. Depois de dissecar o cérebro, homogeneize-o imediatamente em 10 mililitros de tampão de homogeneização em um homogeneizador de vidro no gelo.
Usando aproximadamente 12 traçados, centrifugar os lysates por 15 minutos a 1400 vezes G, e quatro graus Celsius. Transfira o supernatante para um novo tubo no gelo. Resuspenque a pelota em 10 mililitros de tampão de homogeneização.
Homogeneizá-lo usando aproximadamente seis golpes. Centrifugar a suspensão a 710 vezes G e 4 graus Celsius por 10 minutos. Combine os supernacantes e centrifuá-los a 40.000 vezes G e quatro graus Celsius por 20 minutos.
Descarte o supernatante e resuspenque a fração de membrana pelleted em um tampão de homogeneização, quebrando a pelota com uma ponta de pipeta e pipeta para cima e para baixo. Realize o ensaio ABCA para quantificar os níveis de proteína. Para realizar o ensaio APEGS, coloque 470 microliters de tampão A em um tubo de 1,5 mililitro e adicione aproximadamente 100 a 200 miligramas de proteína.
Sonicar o tubo e, em seguida, separar a proteína insolúvel por centrifugação do tubo a 25 graus Celsius e um mínimo de 13.000 vezes G por 10 minutos. Transfira a proteína solubalizada para um novo tubo de 1,5 mililitro. Primeiro, interrompa as ligações de dissulfeto incubando a proteína solubalizada em 25 microliters de TCEP por 60 minutos a 55 graus Celsius.
Em seguida, bloqueie cisteínas livres incubando a solução com 12,5 microliters da solução de estoque de NEM por três horas em temperatura ambiente. Em seguida, comece o processo de precipitação de metanol clorofórmio. Transfira a solução proteica do tubo de 1,5 mililitro para um tubo de polipropileno ou vidro que pode ser centrifugado em um rotor de balde balançando a uma velocidade modesta.
Adicione dois mililitros de metanol e vórtice brevemente. Adicione um mililitro de clorofórmio e vórtice brevemente. Em seguida, adicione 1,5 mililitros de água deionizada e vórtice brevemente novamente.
Se necessário, inverta o tubo para garantir a mistura completa. Centrifugar as amostras a 3000 vezes G e 25 graus Celsius por 30 minutos em um rotor de balde balançando. Remova e descarte cuidadosamente a fase superior da solução em um tubo.
Adicione 1,5 mililitros de metanol. Misture suavemente, mas completamente, por uma suave inversão do tubo, tomando cuidado para não fragmentar a panqueca de proteína opaca. Centrifugar a amostra a 3000 vezes G e 25 graus Celsius por 10 minutos em um rotor de balde balançando.
Usando uma pipeta sorológica de vidro, remova o máximo possível da fase superior da solução sem perturbar a panqueca de proteína. Enxágue cuidadosamente a pelota com um mililitro de metanol e deixe-a secar pelo menos por pelo menos 10 minutos. Com a precipitação de metanol clorofórmio completa, inicie o decote das ligações de tioester palmitoyl, reutilizando o precipitado de proteína em 125 microliters de tampão A.Transfira para um novo tubo de 1,5 mililitro.
Sonicar o tubo brevemente e, em seguida, centrifuá-lo a 13.000 vezes G ou superior e 25 graus Celsius por 10 minutos para remover material insolúvel. Transfira a proteína solubalizada para novos tubos de 1,5 mililitro e adicione 375 microliters de tampão H ou tampão T.Depois de incubar as amostras por 60 minutos à temperatura ambiente, repita a precipitação de metanol de clorofórmio. Para adicionar m-PEG a cisteínas desprotegidas, comece reutilizando a pelota em 100 microliters de tampão A contendo 10 mil ou mais DEXP.
Em seguida, transfira a suspensão para um tubo de 1,5 mililitro. Adicione 25 microliters de solução m-PEG 5K e misture por pipetação. Incubar em temperatura ambiente com final sobre rotação final.
Após 60 minutos de incubação, remova m-PEG 5K não incorporado realizando precipitação de metanol clorofórmio novamente. Centrífuga a mais de 13.000 vezes G e 25 graus Celsius por 10 minutos. Remova cuidadosamente a fase superior como antes, evitando a panqueca espessa e floculante.
Adicione um mililitro de metanol e misture suavemente, mas completamente. Centrífuga a mais de 13.000 vezes G e 25 graus Celsius por 10 minutos. Remova cuidadosamente o supernasce e enxágue a pelota com um mililitro de metanol.
Novamente, centrífuga superior a 13.000 vezes G e 25 graus Celsius por 10 minutos. Após a secagem do ar da pelota, resuspenque-a em 50 microliters de tampão A sem TCEP ou qualquer agente redutor. Reserve 5 microliters da solução para a quantitação da proteína BCA.
Após a quantitação, adicione uma quantidade apropriada de tampão amostral de Laemmli 4x. Carregue a amostra em um gel de página SDS. Use protocolos de transferência e detecção padrão de separação para manchas ocidentais.
Para investigar o estado de palmitoição das proteínas SynDIG, frações de membrana P2 de cérebros de camundongos homogeneizados foram submetidas ao ensaio APEGS. A separação e sondagem com anticorpos demonstraram que SynDIG1, SynDIG4 Prrt1 e Prrt2 são palmitoylated no cérebro do camundongo. O objetivo da precipitação de metanol clorofórmio é evitar que um produto químico, como o NEM, interfira na próxima etapa do protocolo.
Uma precipitação adequada de metanol de clorofórmio removerá produtos químicos indesejáveis, minimizando a perda de proteínas. Este método pode ser aplicado a lises cerebrais de camundongos de diferentes idades ou de diferentes regiões cerebrais para investigar as regulamentações espaço-temporais da palmitoylation.
