この生化学的方法は、適切な抗体が利用可能な脳内で発現される任意の膜タンパク質のパルミトイル化状態の決定を可能にする。この技術の主な利点は、アフィニティー精製を必要とせず、代わりにゲル移動性の変化を利用して、目的のタンパク質の改変数を決定することです。脳を解剖した後、氷上のガラスホモジナイザーで均質化バッファーの10ミリリットルですぐに均質化します。
約12ストロークを使用して、1400倍Gで15分間、摂氏4度の間、ライセートを遠心分離する。上清を氷上の新しいチューブに移します。ペレットを均質化バッファーの 10 ミリリットルに再懸濁します。
約6ストロークで均質化します。サスペンションを710倍Gで、摂氏4度で10分間遠心分離します。上清と遠心分離機を40,000倍Gと摂氏4度で20分間組み合わせます。
上清を捨て、ペレットをピペットチップで分解し、上下にピペット処理することで、ペレット化膜分率を均質化バッファーに再懸濁します。ABCAアッセイを実行してタンパク質レベルを定量化する。APEGSアッセイを実行するには、470マイクロリットルのバッファーAを1.5ミリリットルチューブに入れ、約100~200ミリグラムのタンパク質を加えます。
チューブを超音波処理し、25°Cでチューブを遠心分離し、10分間Gの13,000倍以上で不溶性タンパク質を分離します。水化したタンパク質を新しい1.5ミリリットルチューブに移します。まず、25マイクロリットルのTCEP中の溶解タンパク質を摂氏55度で60分間インキュベートすることにより、二硫化物結合を破壊する。
次いで、NEMのストック溶液12.5マイクロリットルを室温で3時間インキュベートして遊離システインをブロックする。次に、クロロホルムメタノール沈殿のプロセスを開始する。1.5ミリリットルチューブからポリプロピレンまたはガラスチューブにタンパク質溶液を移し、適度な速度で揺れるバケットローターで遠心分離することができます。
メタノールと渦を2ミリリットル加えます。クロロホルムと渦を1ミリリットル加えます。その後、1.5ミリリットルの脱イオン水と渦をもう一度短時間加えます。
必要に応じて、チューブを反転して、徹底的な混合を確実にします。スイングバケットローターで30分間、Gの3000倍と摂氏25度でサンプルを遠心分離します。慎重に除去し、チューブ内の溶液の上相を捨てます.
1.5ミリリットルのメタノールを加えます。不透明なタンパク質パンケーキを断片化しないように注意して、チューブの穏やかな反転によって穏やかだが徹底的に混ぜます。スイングバケットローターで10分間、Gの3000倍と摂氏25度でサンプルを遠心分離します。
ガラス血清ピペットを使用して、タンパク質パンケーキを邪魔することなく、溶液のトップフェーズをできるだけ多く取り除きます。ペレットを1ミリリットルのメタノールで慎重にすすいで、少なくとも10分間空気乾燥させます。クロロホルムメタノール沈殿が完了したら、125マイクロリットルのバッファーA.Transferを新しい1.5ミリリットルチューブに再懸濁させることでパルミトイルチオエステル結合の切断を開始します。
チューブを短時間超音波処理し、不溶性物質を除去するために13,000倍G以上、摂氏25度で遠心分離します。水化したタンパク質を新しい1.5ミリリットルチューブに移し、375マイクロリットルのバッファーHまたはバッファT.室温でサンプルを60分間インキュベートした後、クロロホルムメタノール沈殿を繰り返します。保護されていないシステインにm-PEGを添加するには、10mil以上のTCEPを含む100マイクロリットルのバッファーAにペレットを再懸濁させることから始める。
その後、懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移します。25マイクロリットルのストックM-PEG 5K溶液を加え、ピペットで混合します。終点回転で室温でインキュベートします。
60分間のインキュベーションの後、クロロホルムメタノール沈殿を再度行うことにより非法人m-PEG5Kを除去した。13,000倍Gと摂氏25度を超える遠心分離機を10分間。厚くて凝集したパンケーキを避けて、以前と同じくらい慎重に上相を取り除きます。
1ミリリットルのメタノールを加え、穏やかに、しかし十分に混ぜます。13,000倍Gと摂氏25度を超える遠心分離機を10分間。上清を慎重に取り除き、1ミリリットルのメタノールでペレットをすすきます。
繰り返しますが、遠心分離機は13,000倍Gを超え、摂氏25度で10分間です。ペレットを空気乾燥させた後、TCEPまたは任意の還元剤を使用せずに50マイクロリットルのバッファーAで再懸濁する。BCAタンパク質定量用に溶液の5マイクロリットルを予約してください。
定量後、適切な量の4倍のレムリサンプルバッファーを加えます。サンプルを SDS ページゲルにロードします。ウェスタンブロッティングには標準の分離転送および検出プロトコルを使用してください。
SynDIGタンパク質のパルミトリューション状態を調べるため、均質化マウス脳からのP2膜画分をAPEGSアッセイに供した。抗体による分離とプローブは、SynDIG1、SynDIG4 Prrt1、およびPrrt2がマウス脳でパルミトレートされていることを実証した。クロロホルムメタノール沈殿の目的は、NEMのような1つの化学物質を防止し、プロトコルの次のステップを妨害することにある。
適切なクロロホルムメタノール沈殿は、タンパク質の損失を最小限に抑えながら、望ましくない化学物質を除去します。この方法は、異なる年齢のマウスまたは異なる脳領域からの脳ライセートに適用され、パルミトイル化の空間的時間的規制を調査することができる。
