كمية المعلومات من تجربة واحدة فقط هائلة. يمكننا الكشف عن وجود هذه البوليمرات جدار الخلية ونعرف بالضبط كيف يتم توزيعها في الخلايا والأنسجة، وحتى تحديد وفرة. تم تصميم هذه الطريقة في مثل هذه الطريقة التي يمكن تطبيقها على أي نوع تقريبا من الأنسجة النباتية من أي نوع قد ترغب في تحليل.
مناعة في الأنسجة النباتية ينطوي على الكثير من العمل الدقيق، من الصعب شرح دون رؤية الواقع ما يحدث. قبل جمع عينة الأنسجة النباتية، تعبئة قارورة الزجاج مع ما يكفي من حل المثبت الباردة لغمر تماما جميع العينات. ثم حدد الأنسجة النباتية لتحليلها وتقليم العينات إلى حجم لا يزيد عن 16 ملليمتر مربع.
غمر العينات على الفور في الحل المثبت. الجلثارالدهيد والفورمالديهايد كلاهما المثبتات ممتازة، ولكن كلاهما خطرة ويجب التعامل معها في غطاء محرك التدفق. نقل القارورة إلى غرفة فراغ وتطبيق الفراغ ببطء.
عندما يصل الضغط إلى 60 كيلو باسكال سالبة، المادة العائمة في القارورة ستبدأ في الغرق إلى القاع. الحفاظ على الضغط في الغرفة في ما لا يزيد عن باسكال 80 كيلو سلبي. قد تستغرق عملية الغرق ما يصل إلى ساعتين.
بعد العينات كانت في غرفة فراغ لمدة ساعتين ، ببطء الإفراج عن الفراغ. ختم قارورة الزجاج وتبريده بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. بعد التثبيت بين عشية وضحاها، والتخلص من أي عينات التي لم تغرق في الجزء السفلي من القارورة.
غسل العينات المتبقية مع PBS 25 ملليمولار لمدة 10 دقائق ثم غسلها في 25 ميليمولار أنابيب العازلة لمدة 20 دقيقة. من المهم للغاية إزالة جميع العينات العائمة لأنه من المحتمل جدا أن المثبت لم تخترق العينة. يجفف العينات في سلسلة الإيثانول، ويغمر العينات لمدة 20 دقيقة عند كل تركيز الإيثانول.
لثقب العينات، إضافة تركيزات متزايدة من راتنج LR-أبيض في الإيثانول، بدءا من راتنج جزء واحد إلى ثلاثة أجزاء الإيثانول. في كل تركيز، احتضان لمدة 24 ساعة في أربع درجات مئوية. استبدال راتنج LR-أبيض مع الراتنج الطازجة واحتضان العينات لمدة 12 ساعة إضافية في أربع درجات مئوية.
إعداد كبسولات الجيلاتين التضمين، واختيار كبسولات التي هي أكبر قليلا من العينات بحيث يمكن أن تكون مغلقة تماما العينات في الراتنج. علامات الورق التسمية مع قلم رصاص لأن الحبر سوف تلوث الراتنج. تطبيق قطرة واحدة من الراتنج LR-أبيض جديد إلى الجزء السفلي من كل كبسولة.
ضع عينة في كل كبسولة، ثم املأ الكبسولات بأقصى سعة مع الراتنج الطازج. ضع الغطاء على الكبسولة واضغط بلطف لختمه. لتبليمرة الراتنج، علاج كبسولات في 58 درجة مئوية حتى تصلب تماما حول 24 إلى 48 ساعة.
بعد تقشير كبسولة الجيلاتين من الراتنج LR-أبيض، ضع كتلة الراتنج تحت المجهر ستيريو. باستخدام شفرة حلاقة حادة، تقليم كتلة LR-أبيض في زاوية 45 درجة إلى العينة. تدوير العينة وجعل خفض الثانية في زاوية 90 درجة إلى الأولى.
استمر في القطع في نفس النمط لتشكيل هرم مع قمة الهرم مباشرة فوق منطقة العينة ذات الاهتمام ، ثم البدء في إزالة الشرائح الدقيقة عموديًا على المحور الرئيسي حتى يصل سطح القطع إلى العينة. يجب أن تكون العينة الهدف بشكل مثالي محاطة في شكل شبه منحرف. ضع كتلة الراتنج المشذبة في الدقيقة الفائقة.
ضبط الزاوية بين حافة السكين وكتلة الراتنج. قطع أجزاء من كتلة بسماكة تتراوح بين 200 و 700 نانومتر. استخدام حلقة سلك لرفع بعناية بعض المقاطع العينات من microtome.
وضعها في قطرة من الماء المقطر ديونيد على شريحة زجاجية. يتبخر الماء عن طريق وضع الشريحة على لوحة ساخنة في 50 درجة مئوية، ثم إضافة قطرة من وصمة عار إلى الأقسام. بعد 30 ثانية، شطف قبالة وصمة عار ومراقبة الشريحة تحت المجهر للتحقق من الحالة العامة للقسم، وأن بنية النبات المطلوب مرئية.
إعداد شريحة رد فعل نظيفة عن طريق وضع قطرة من الماء المقطر deionized في كل بئر من الشريحة. نقل واحد أو قسمين عينة إلى كل قطرة من الماء. ضع الشريحة في طبق بيتري 10 سنتيمتر مربع، غطيه واتركه يجف عند 50 درجة مئوية.
لإعداد غرفة حضانة للشرائح رد فعل، ووضع بعض المناشف الورقية المثبطة في الجزء السفلي من مربع نصائح ماصة والتفاف مربع مع رقائق الألومنيوم. نقل الشرائح من مربع إلى غرفة الحضانة. الماصات 50 ميكرولترات من حل الحجب في كل بئر.
بعد احتضان الشريحة لمدة 10 دقائق، قم بإزالة حل الحجب، ثم اغسل جميع الآبار مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في كل مرة. بعد تحضير حلول الأجسام المضادة الأولية كما هو موضح في المخطوطة، قم بإجراء غسل نهائي للآبار بالماء التقطيري لمدة خمس دقائق. الماصات الحل الأجسام المضادة الأولية في آبار رد الفعل، ثم ماصة الحل حظر في آبار التحكم.
أغلق غرفة الحضانة. اتركه يقف لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ثم ابرده بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. إعداد 1٪ حل من الأجسام المضادة الثانوية في حل حظر.
وسوف تكون هناك حاجة إلى ما يقرب من 40 ميكرولترات لكل بئر. تغطية الحل مع رقائق الألومنيوم. اغسل آبار شريحة التفاعل مرتين مع PBS ومرة واحدة مع الماء المقطر المقطّر لمدة 10 دقائق في كل مرة.
ضمان عدم وجود حل للحجب أو ودائع في الآبار. الماصات حل الأجسام المضادة الثانوية في جميع الآبار. احتضان الشرائح في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث إلى أربع ساعات.
مرة أخرى، وغسل آبار الشريحة رد فعل مرتين مع برنامج تلفزيوني ومرة واحدة مع الماء المقطر deionized، ثم إضافة قطرة من كالكفلور الأبيض إلى كل بئر. دون غسل، إضافة قطرة من متوسطة التركيب لكل بئر وتغطي كل بئر مع غطاء. مراقبة أجزاء العينة في الشريحة رد الفعل باستخدام المجهر المفلور.
لكل ملاحظة، استخدم فلتر الأشعة فوق البنفسجية للكشف عن جدران الخلايا الملطخة بالكالكوفلور ومرشح فيتف للكشف عن تحديد المواقع المناعية. للحصول على تصور أفضل للنتائج، استخدم ImageJ أو برنامج تحليل صور مشابه لدمج كل صورة مرشح الأشعة فوق البنفسجية مع صورة مرشح FITC المقابلة. من خلال تحديد توطين epitopes محددة ، والبروتوكول يتيح توصيف تكوين جدار الخلية.
على سبيل المثال، 1، 5-عربيان وفيرة في جدار الخلية من النمو Quercus suber anther. عادة ما توجد المثليات المهجورة التي نادراً ما تكون في الطرف الجذري للجنين الفرعي Quercus الذي يحدد الخصائص الميكانيكية للجهاز. تم العثور على Xylogalacturonanans في الخلايا المتحللة، مثل خلية إندوسبيرم أثناء المراحل النهائية لنضوج البلوط البلوط الفرعي Quercus.
تم العثور على epitopes AGP المعترف بها من قبل JIM13 أو JIM8 على الهياكل المتعلقة بالإنجاب، مثل خطوط الخلايا المتعلقة microgametogenesis في Arabidopsis thaliana وspiillae وصمة عار والميكروبات من الاجم رثوريا البازل. وعادة ما يسهل اكتشاف الأخطاء الشائعة في تنفيذ هذا البروتوكول وتحديدها. عندما يتم تخطي الغسلات أو السماح لآبار التفاعل بالجفاف ، فإن الجسم المضاد الثانوي عادة ما يظهر كلطخة.
سوف تتكون مجاميع من الفلوروكرروم الأخضر إذا لم يتم غسل الجسم المضاد الأساسي غير المنضم بشكل صحيح. عادة ما يرتبط طي أو انفصال الأقسام إلى التصاق الفقراء بسبب استخدام الشرائح غير نظيفة أو غسل العدوانية. إعداد العينة هو أيضا بالغ الأهمية.
يجب أن تكون كتل الراتنج خالية من الشقوق مع أصفر شاحب واضح إلى عينة بنية فاتحة. سوف تظهر العينات المدمجة بشكل غير فعال بقع بيضاء مسحوق أو مناطق. الحفاظ على حجم العينة تحت ثمانية ملليمترات ضروري لاختراق الحل المثبت.
سوف تظهر عينات ثابتة بشكل سيئ بنية داكنة أو سوداء تقريبًا. درجة الحرارة المفرطة يمكن أن يسبب الراتنج للقضاء جعل القطاعات من العينة المستحيل. استخدام تقنيات تخصيص المناعة فتح العديد من الاتجاهات البحثية.
يمكن للمرء أن يتبع مع تقنيات أكثر تحديدا مثل التحليل الكيميائي الحيوي للجدار الخلية أو حتى المضي قدما في نهج الجزيئية. يمكن أن تساعد النتائج التي توفرها هذه التقنية على فهم تكوين جدار الخلية ، وهو هيكل معقد للغاية يصعب تحليله عن طريق التحليل الكيميائي البسيط.
