يستخدم أسلوبنا اختيار مجموعة المضيف وعلامات الفلورسنت لتوليد كفاءة وسلس من فيروس vaccina المؤتلف في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. هذه التقنية تجمع بين سرعة إعادة التركيب المتجانسة مع الطبيعة عديمة الندبة للاختيار المهيمن العابر. وبالإضافة إلى ذلك، نحن استضافة مجموعة مختارة للقضاء على إمكانية التغييرات الناجمة كيميائيا.
ويمكن استخدام هذه الطريقة أيضا لتعديل فيروس التشنج أو فيروس الجدري الأخرى للتعبير عن الجينات الأجنبية، على سبيل المثال، لتوليد اللقاحات. إذا كنت تقوم بتنفيذ هذا البروتوكول مع تحديد الفلوريسنس فقط، يجب عليك التأكد من فحص ما يكفي من الفيروسات للكشف عن عمليات إعادة الكومبينات النادرة نسبيًا بدون ضغط انتقائي من PKR. ويعتمد هذا الأسلوب على كسب وخسارة علامات الفلورسنت لتحديد الفيروسات التي حصلت على أشرطة إعادة التركيب والكشف عن الفيروسات التي تم إعادة تجميعها بدون خدش.
لتوليد ناقل إعادة الكومبونيشن، أولا إضافة 17 ميكرولترات من المياه الحرة DNase، 1.2 ميكرولترات من كل التمهيدي، وخمسة microliters من 5x PCR العازلة التفاعل، والحمض النووي قالب، و 0.5 ميكرولترات من البوليميراز الحمض النووي إلى أنبوب PCR واحد لكل أمبيرليكون. إضافة المياه مجاناً DNase إضافية لتحقيق حجم النهائي في كل أنبوب إلى 50 ميكرولترات. ووضع الأنابيب في ثيركلوسير.
تذوب الحمض النووي في 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية قبل استخدام 25 طلقة من بروتوكول PCR من ثلاث خطوات كما هو مبين. لتصور منتجات التضخيم على جل agarose 1٪، إضافة 10 ميكرولترات من كل منتج الحمض النووي و 2 microliters من تحميل العازلة لكل بئر. تشغيل الجل لمدة ساعة واحدة في ثمانية فولت في السنتيمتر الواحد.
في نهاية المدى، واستخدام طقم استخراج هلام الحمض النووي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة لتنقية هلام كل أمبليكون. Elute amplicons من العمود مع 50 ميكرولترات من المياه الحرة DNase والطرد المركزي الفوري. لتكرار ناقل الاستنساخ، أولا إضافة ميكروغرام واحد من الناقل، 17 ميكرولترات من المياه الحرة DNase، 2 ميكرولتر من العازلة رد فعل، و 1 ميكرولتر من EcoRI إلى أنبوب لمدة ساعة واحدة الحضانة في 37 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة، إضافة 0.2 picomoles من ناقلات خطية 10 ميكرولترات من المياه الحرة DNase، و 10 ميكرولترات من الحمض النووي الجمع مزيج ماجستير لكل أمبريكون معزولة. احتضان العينات في 50 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة، وتحويل E.coli المختصة كيميائيا مع اثنين من microliters من المنتج المجمعة وفقا للبروتوكولات القياسية.
لوحة 100 ميكرولتر من الخلايا المحولة على لوحات أكاروز LB تكملها 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأمبيسيلين. بعد الحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، حدد المستعمرات المعزولة جيدا لللقح في مرق لوريا تستكمل مع 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأمبيسيلين بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 225 الثورات في الدقيقة الواحدة. في صباح اليوم التالي، استخدمي عدة مصغرة بلازميد لعزل البلازميدات.
وتحقق من تركيز ونقاء الحمض النووي على مقياس الطيف. لتوليد الفيروس المؤتلف، تصيب أحادية التقاء من الخلايا المناسبة مع الفيروس ليتم إعادة دمجها في تعدد العدوى من واحد في لوحة ستة جيدا. واحتضان الخلايا المصابة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة.
في نهاية الحضانة، استبدال المابير في كل بئر مع DMEM الطازجة واستخدام كاشف transfection المتاحة تجاريا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. إضافة ثلاثة ميكروغرام من ناقلات إعادة الكومبينيشن من الفائدة لكل بئر. ضع اللوحة في الحاضنة لمدة 48 ساعة إضافية.
قبل تجميع الخلايا من كل حالة transfection في أنابيب 1.5 ملليلتر الفردية. ثم تجميد ذوبان الخلايا المجمعة ثلاث مرات قبل sonicating lysates الناتجة لمدة 15 ثانية في 50٪ السعة. المقبل، serially 10-fold تمييع lysate سونيكاتيد، حصادها من 10 إلى الأول إلى 10 إلى التركيز السادس في DMEM الطازجة وإضافة ملليلتر واحد من كل تخفيف إلى آبار التقاء الفردية من بروتين كيناز R خط الخلية المختصة.
وضع الخلايا في الحاضنة ثقافة الخلية لمدة ساعة واحدة قبل استبدال supernatants مع المتوسطة الطازجة وإعادة الخلايا إلى الحاضنة ثقافة الخلية. بعد 24 إلى 48 ساعة، تحديد الفيروسات المؤتلفة عن طريق المجهر الفلوري. لويحات من الفيروسات المؤتلفة التعبير عن الفلورس الأحمر بسبب التكامل بين الجين الانصهار mCherry-E3L.
البلاك تنقية الفيروسات المؤتلفة ثلاث مرات على أنواع البرية RK13 الخلايا. بعد ثلاث جولات من تنقية البلاك، تصيب خلايا RK13 +E3L+K3L مع التخفيفات التسلسلية للبلاك. لتحديد الفيروسات المنهارة، عن طريق المجهر الفلوريسنس باستخدام نظام التصوير المناسب مجهزة GFP ومكعبات التصفية RFP.
ثم البلاك تنقية الأخضر فقط VC-R4، أو لويحات E3L عديم اللون ثلاث مرات على RK13 + E3L + K3L الخلايا. ضمان عدم وجود لويحات الفلوريس الحمراء. تصيب الخلايا مع ما لا يقل عن 100 لوحة تشكيل وحدات لزيادة فرصك في تحديد لوحة عديم اللون.
في حالات نادرة، قد تكون هناك حاجة إلى جولات متعددة من العدوى. لويحات الفلورسنت الحمراء في البروتين كيناز R المختصة RK13 الخلايا تدل على التعبير الفيروسي من mCherry-E3L. واللوحات أو اللوحات التي تعبر عن eGFP فقط في خلايا RK13 +E3L+K3L تؤكد انهيار علامة اختيار mCherry-E3L.
لا يمكن لفيروس المؤتلف VC-R4، الذي يفتقر إلى كل من مضادات كيناز R البروتينية تكرار في البروتين كيناز R المختصة RK13 الخلايا بينما فيروس واضح VP872، الذي يعبر عن E3L هو النسخ المتماثل المختصة. للتأكد من أن هذا العجز عن تكرار في خلايا RK13 كان فقط بسبب فقدان E3L، تم استبدال GFP المحسنة مع E3L في فيروس VC-R4. ولدت فيروس ذات الصلة باستخدام نفس بروتوكول الاختيار.
ومن المثير للاهتمام، في حين جعل هذا الفيروس، تم تحديد لويحات عديم اللون متسقة مع انهيار علامة اختيار mCherry-E3L قبل الاختيار في RK13 + E3L + K3L الخلايا التي هي عموما مطلوبة لتحديد المؤتلفات scarless. على الأرجح بسبب هوية التسلسل الممتدة بين كاسيت إعادة الدمج mCherry-E3L والمورث E3L يتم إدراجها في VC-R4. في المتوسط 12.6٪ من الفيرات ذرية خضع التأتلف مع البلازميد عبر، على غرار الترددات التي سبق الإبلاغ عنها.
هنا، يتم عرض وتيرة لويحات عديم اللون نسبة إلى مجموع لويحات RK13 + E3L + K3L الخلايا، مما يدل على أن معدل الانهيار وفقدان علامة اختيار mCherry-E3L وقعت في تردد 1.8٪تقريبا. في المرحلة الأولى باستخدام الخلايا المختصة PKR يضمن أن جميع اللويحات مع فيروس المؤتلف الواردة. في المرحلة الثانية باستخدام الخلايا الناقصة PKR تمكن من الكشف عن الفيروس المؤتلف مع طي mCherry-E3L locus.
ويتيح لنا هذا النهج توليد فيروسات بسرعة تحتوي على جينات خارجية، على سبيل المثال، لإنتاج اللقاحات الذي يقدم تعبير مختلف الخصوم الفيروسيين من نوع PKR. لتسهيل تحليل التفاعلات الخاصة بالأنواع مع PKR من مختلف المضيفين.
