Unsere Methode verwendet Hostbereichsauswahl und Fluoreszenzmarker für die effiziente und nahtlose Generierung von rekombinanten Impfstoffen in einer Vielzahl von Zelltypen. Diese Technik kombiniert die Geschwindigkeit der homologen Rekombination mit der narbenlosen Natur der transienten dominanten Selektion. Darüber hinaus hosten wir eine Sortimentsauswahl, um die Möglichkeit chemisch induzierter Veränderungen auszuschließen.
Diese Methode kann auch verwendet werden, um Impfvirus oder andere Poxviren zu modifizieren, um fremde Gene auszudrücken, zum Beispiel, um Impfstoffe zu erzeugen. Wenn Sie dieses Protokoll nur mit Fluoreszenzauswahl durchführen, müssen Sie sicherstellen, dass Sie genügend Viren screenings, um relativ seltene Rekombinanten ohne selektiven PKR-Druck zu erkennen. Diese Methode beruht auf dem Gewinn und Verlust von Fluoreszenzmarkern, um erfolgreich Viren auszuwählen, die die Rekombinationskassetten erworben haben, und um Viren zu erkennen, die narbenlos neu kombiniert wurden.
Um einen Rekombinationsvektor zu erzeugen, fügen Sie zunächst 17 Mikroliter DNase freies Wasser, 1,2 Mikroliter pro Primer, fünf Mikroliter 5x PCR-Reaktionspuffer, Vorlagen-DNA und 0,5 Mikroliter DNA-Polymerase zu einem PCR-Röhrchen pro Amplikon hinzu. Fügen Sie zusätzliches DNase-freies Wasser hinzu, um das Endvolumen in jedem Rohr auf 50 Mikroliter zu bringen. Und legen Sie die Rohre in einen Thermocycler.
Schmelzen Sie die DNA bei 98 Grad Celsius für 30 Sekunden, bevor Sie 25 Runden eines dreistufigen PCR-Protokolls verwenden, wie angegeben. Um die Amplifikationsprodukte auf einem 1%Agarose-Gel zu visualisieren, fügen Sie 10 Mikroliter jedes DNA-Produkts und 2 Mikroliter Ladepuffer zu jedem Brunnen hinzu. Führen Sie das Gel für eine Stunde bei acht Volt pro Zentimeter.
Verwenden Sie am Ende des Laufs ein DNA-Gel-Extraktionskit gemäß dem Herstellerprotokoll, um jedes Amplicon zu reinigen. Elute die Amplicons aus der Säule mit 50 Mikroliter DNase freies Wasser und sofortige Zentrifugation. Um einen Klonvektor linearisieren, fügen Sie zunächst ein Mikrogramm des Vektors, 17 Mikroliter DNase freies Wasser, 2 Mikroliter Reaktionspuffer und 1 Mikroliter EcoRI zu einem Rohr für eine eine Stunde Inkubation bei 37 Grad Celsius hinzu.
Am Ende der Inkubation 0,2 Picomole des linearisierten Vektors 10 Mikroliter DNase freies Wasser und 10 Mikroliter DNA-Montagemaster-Mischung zu jedem isolierten Amplicon hinzufügen. Inkubieren Sie Proben bei 50 Grad Celsius für eine Stunde. Am Ende der Inkubation chemisch kompetente E.coli mit zwei Mikrolitern des montierten Produkts nach Standardprotokollen transformieren.
Platte 100 Mikroliter transformierte Zellen auf LB-Agarose-Platten ergänzt mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin. Nach der nächtlichen Inkubation bei 37 Grad Celsius wählen Sie gut isolierte Kolonien zur Impfung in Luria-Brühe, ergänzt mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin über Nacht bei 37 Grad Celsius und 225 Umdrehungen pro Minute. Verwenden Sie am nächsten Morgen ein Plasmid-Miniprep-Kit, um die Plasmide zu isolieren.
Und überprüfen Sie die Konzentration und Reinheit der DNA auf einem Spektralphotometer. Für die rekombinante Virusgenerierung, infizieren Sie eine konfluente Monoschicht geeigneter Zellen mit dem Virus, das bei einer Vielzahl von Infektionen von einer in einer Sechs-Well-Platte rekombiniert werden soll. Und die infizierten Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für eine Stunde inkubieren.
Ersetzen Sie am Ende der Inkubation den Überstand in jedem Brunnen durch frisches DMEM und verwenden Sie ein handelsübliches Transfektionsreagenz nach dem Herstellerprotokoll. Fügen Sie jedem Brunnen drei Mikrogramm des Rekombinationsvektors hinzu. Legen Sie die Platte für weitere 48 Stunden in den Inkubator.
Vor der Bündelung der Zellen aus jedem Transfektionszustand in einzelne 1,5 Milliliter-Röhren. Dann frieren Sie die gepoolten Zellen dreimal ein, bevor Sie die resultierenden Lysate 15 Sekunden lang bei einer Amplitude von 50 % beschallen. Als nächstes wird das beschallte Lysat, das von 10 bis 10 bis zur sechsten Konzentration in frischem DMEM geerntet wird, seriell 10-fach verdünnt und einen Milliliter jeder Verdünnung in einzelne Konfluentbrunnen einer Proteinkinase R-fähigen Zelllinie hinzugefügt.
Platzieren Sie die Zellen für eine Stunde im Zellkultur-Inkubator, bevor Sie die Überstande durch ein frisches Medium ersetzen und die Zellen in den Zellkultur-Inkubator zurückführen. Identifizieren Sie nach 24 bis 48 Stunden die rekombinanten Viren durch Fluoreszenzmikroskopie. Plaques von rekombinanten Viren drücken aufgrund der Integration des mCherry-E3L-Fusionsgens rote Fluoreszenz aus.
Plaque reinigen die rekombinanten Viren dreimal auf wildTyp RK13 Zellen. Nach drei Runden Plaquereinigung RK13+E3L+K3L-Zellen mit seriellen Verdünnungen des Plaquelysats infizieren. Um die zusammengebrochenen Viren zu identifizieren, durch Fluoreszenzmikroskopie mit einem geeigneten Bildgebungssystem, das mit GFP- und RFP-Filterwürfeln ausgestattet ist.
Dann Plaque reinigen grün-nur VC-R4, oder farblose E3L Plaques dreimal auf RK13 + E3L + K3L Zellen. Sicherstellen, dass keine Plaques rot fluoreszieren. Infizieren Sie die Zellen mit mindestens 100 Plaque bildenden Einheiten, um Ihre Chancen zu erhöhen, eine farblose Plaque zu identifizieren.
In seltenen Fällen können mehrere Infektionsrunden erforderlich sein. Rote fluoreszierende Plaques in Proteinkinase R-kompetenten RK13-Zellen deuten auf eine virale Expression von mCherry-E3L hin. Und farblose Plaques oder Plaques, die nur eGFP in RK13+E3L+K3L-Zellen exdrücken, bestätigen den Zusammenbruch des mCherry-E3L-Auswahlmarkers.
Das rekombinante Virus VC-R4, dem beide Proteinkinase-R-Antagonisten fehlen, kann sich nicht in Proteinkinase R-kompetenten RK13-Zellen replizieren, während das scheinbare Virus VP872, das E3L ausdrückt, für die Replikation zuständig ist. Um zu bestätigen, dass diese Unfähigkeit, sich in RK13-Zellen zu replizieren, nur auf den Verlust von E3L zurückzuführen war, wurde das erweiterte GFP durch E3L im VC-R4-Virus ersetzt. Es generierte einen relevanten Virus mit dem gleichen Auswahlprotokoll.
Interessanterweise wurden bei der Herstellung dieses Virus farblose Plaques, die mit dem Kollaps des mCherry-E3L-Auswahlmarkers konsistent sind, vor der Auswahl in RK13+E3L+K3L-Zellen identifiziert, die in der Regel zur Auswahl von narbenlosen Rekombinanten erforderlich sind. Wahrscheinlich aufgrund der erweiterten Sequenzidentität zwischen der mCherry-E3L-Rekombinationskassette und dem E3L-Gen, das in VC-R4 eingeführt wird. Im Durchschnitt wurden 12,6 % der Nachkommenvirionen mit dem transfizierten Plasmid rekombiniert, ähnlich wie zuvor gemeldete Frequenzen.
Hier wird die Häufigkeit farbloser Plaques relativ zu den gesamten Plaques RK13+E3L+K3L-Zellen gezeigt, was zeigt, dass die Kollapsrate und der Verlust des mCherry-E3L-Auswahlmarkers mit einer Häufigkeit von etwa 1,8% aufgetreten sind. In der ersten Phase mit PKR kompetente Zellen sorgt dafür, dass alle Plaques mit enthalten enziellten rekombinanten Virus. In der zweiten Stufe mit PKR-Mangelzellen ermöglicht die Detektion von rekombinanten Viren mit einem Kollaps mCherry-E3L Locus.
Dieser Ansatz ermöglicht es uns, schnell Viren zu erzeugen, die exogene Gene enthalten, zum Beispiel für die Impfstoffproduktion bieten die Expression von verschiedenen viralen PKR-Antagonisten. die Analyse artspezifischer Wechselwirkungen mit PKR von verschiedenen Wirten zu erleichtern.
