Yöntemimiz, çeşitli hücre tiplerinde rekombinant vaccina virüsünün verimli ve sorunsuz üretimi için konak aralığı seçimi ve floresan belirteçleri kullanır. Bu teknik, homolog rekombinasyon hızını geçici baskın seçilimin yarasız doğasıyla birleştirir. Buna ek olarak, kimyasal olarak indüklenen değişiklikler olasılığını ortadan kaldırmak için aralık seçimi ev sahipliği.
Bu yöntem aynı zamanda aşı oluşturmak için, örneğin, yabancı genleri ifade etmek için vaccinia virüs veya diğer çiçek virüsleri değiştirmek için kullanılabilir. Bu protokolü yalnızca floresan seçimiyle gerçekleştiriyorsanız, PKR seçici basınç olmadan nispeten nadir bulunan rekombinanları algılayacak kadar virüs taradığınızdan emin olmalısınız. Bu yöntem, rekombinasyon kasetlerini elde etmiş virüsleri başarılı bir şekilde seçmek ve yara sız yeniden biraraya gelmiş virüsleri tespit etmek için floresan belirteçlerin kazanımı ve kaybına dayanır.
Bir rekombinasyon vektörü oluşturmak için, ilk olarak 17 mikrolitre DNase serbest su, her astarın 1,2 mikrolitresi, 5x PCR reaksiyon arabelleği, şablon DNA ve 0,5 mikrolitre DNA polimeraz mikrolitresini amplicon başına bir PCR tüpüne ekleyin. 50 mikrolitre her tüpte son hacmi getirmek için ek DNase ücretsiz su ekleyin. Ve tüpleri bir termocycler içine yerleştirin.
Belirtildiği gibi üç adımlı PCR protokolünün 25 mermisini kullanmadan önce DNA'yı 98 derecede 30 saniye eritin. Amplifikasyon ürünlerini %1'lik bir agarose jel üzerinde görselleştirmek için, her BIR KUYUYA 10 mikrolitre ve 2 mikrolitre yükleme tamponu ekleyin. Santimetre başına sekiz volt jel bir saat çalıştırın.
Çalışma sonunda, her amplicon arındırmak için üreticinin protokolüne göre bir DNA jeli çıkarma kiti kullanın. DNase serbest su ve hemen santrifüj 50 mikrolitre ile sütundan amplicons elute. Bir klonlama vektörünü doğrusallaştırmak için, önce vektörün bir mikrogramını, 17 mikrolitre DNase serbest suyunu, 2 mikrolitre reaksiyon tamponunu ve 1 mikrolitre EcoRI'yi 37 santigrat derecede bir saatlik kuluçka için bir tüpe ekleyin.
Kuluçka sonunda, doğrusallaştırılmış vektör 10 mikrolitre DNase serbest su pikomoles ekleyin ve her izole amplicon DNA montaj ana karışımı 10 mikrolitre. Bir saat boyunca 50 santigrat derecede kuluçka örnekleri. Kuluçka sonunda, kimyasal olarak yetkin E.coli'yi, monte edilen ürünün iki mikrolitresi ile standart protokollere göre dönüştürün.
Lb agarose plakaları üzerine dönüştürülmüş hücrelerin Plaka 100 mikrolitre ampisilin mililitre başına 100 mikrogram ile desteklenmektedir. 37 santigrat derece gecede kuluçka sonra, Luria suyu aşılama için iyi izole koloniler seçin 37 derece Santigrat ve dakikada 225 devrimleri gecede ampisilin mililitre başına 100 mikrogram ile takviye. Ertesi sabah, plazmidleri izole etmek için plazmid miniprep kiti kullanın.
Ve dna'nın konsantrasyonuna ve saflığını spektrofotometrede kontrol edin. Rekombinant virüs üretimi için, uygun hücrelerin bir confluent monolayer virüs ile bir enfeksiyon bir altı iyi plaka bir enfeksiyon çokluğu yeniden birleştirilmesi için enfekte. Ve enfekte hücreleri 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle bir saat kuluçkaya yatırın.
Kuluçka sonunda, her kuyudaki süpernatant'ı taze DMEM ile değiştirin ve üreticinin protokolüne göre ticari olarak kullanılabilen bir transfeksiyon reaktifi kullanarak. Her bir kuyuya rekombinasyon vektörünün üç mikrogramını ekleyin. Ek 48 saat için kuvözde plaka yerleştirin.
Her transfection durumundan hücreleri tek tek 1,5 mililitre tüpler halinde birleştirmeden önce. Daha sonra havuzdaki hücreleri %50 genlikte 15 saniye sonicating önce üç kez dondurun-eritin. Daha sonra, seri olarak 10 kat seyreltilmiş sonicated lysate, taze DMEM altıncı konsantrasyoniçin 10 ilk hasat ve bir protein kinizaz R yetkili hücre hattı nın bireysel confluent wells her seyreltme bir mililitre ekleyin.
Süpernatantları taze ortamla değiştirmeden ve hücreleri hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürmeden önce hücreleri bir saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. 24 ila 48 saat sonra floresan mikroskobu ile rekombinant virüsleri tanımlayın. Rekombinant virüslerden gelen plaklar mCherry-E3L füzyon geninin entegrasyonu nedeniyle kırmızı floresanı ifade eder.
Plak yabani tip RK13 hücrelerinde rekombinant virüsleri üç kez arındırMak. Üç tur plak arındıktan sonra RK13+E3L+K3L hücrelerine plak lisatının seri seyreltmeleri ile bulaşın. GFP ve RFP filtre küpleri ile donatılmış uygun bir görüntüleme sistemi kullanarak floresan mikroskobu ile çöken virüsleri tanımlamak için.
Daha sonra plak, RK13+E3L+K3L hücrelerinde sadece yeşil VC-R4 veya renksiz E3L plaklarını üç kez temizler. Hiçbir plak floresan kırmızı sağlanması. Renksiz bir plak tanımlama şansınızı artırmak için en az 100 plak şekillendirme üniteleri ile hücreleri enfekte.
Nadir durumlarda, birden fazla enfeksiyon tur gerekli olabilir. Protein kiazr R yetkili RK13 hücrelerinde kırmızı floresan plaklar mCherry-E3L viral ekspresyonun göstergesidir. Rk13+E3L+K3L hücrelerinde sadece eGFP'yi ifade eden renksiz plaklar veya plaklar mCherry-E3L seçim işaretinin çöküşünü doğrular.
Rekombinant virüs VC-R4, her iki protein kiazaz R antagonistleri yoksun protein kiaz r yetkili RK13 hücrelerinde çoğalamaz görünür virüs VP872, E3L ifade ise çoğaltma yetkilidir. RK13 hücrelerinde çoğalamamasının sadece E3L kaybından kaynaklandığını doğrulamak için, geliştirilmiş GFP VC-R4 virüsünde E3L ile değiştirildi. Aynı seçim protokolünü kullanarak ilgili bir virüs oluşturdu.
İlginçtir ki, bu virüsü oluştururken, genellikle scarless rekombinantları seçmek için gerekli olan RK13+E3L+K3L hücrelerinde seçilmeden önce mCherry-E3L seçim belirtecinin çöküşüile tutarlı renksiz plaklar tespit edilmiştir. Muhtemelen mCherry-E3L rekombinasyon kaseti ile VC-R4'e yerleştirilen E3L geni arasındaki genişletilmiş dizi kimliği nedeniyle. Singeny virions ortalama% 12.6 transfected plazmid ile rekombinasyon yapıldı, daha önce bildirilen frekansları benzer.
Burada rk13+E3L+K3L hücrelerinin toplam plaklarına göre renksiz plakların sıklığı gösterilmiş, çökme oranı ve mCherry-E3L seçim belirteci kaybının yaklaşık %1.8 sıklıkta meydana geldiği gösterilmiştir. PKR yetkili hücreleri kullanarak ilk aşamada tüm plaklar rekombinant virüs içeren sağlar. PKR eksik hücreleri kullanarak ikinci aşamada bir çöküş mCherry-E3L locus ile rekombinant virüsün tespiti sağlar.
Bu yaklaşım bize hızla eksojen genler içeren virüsler üretmek için izin verir, örneğin, aşı üretimi için farklı viral PKR antagonistleri ifade sunuyoruz. çeşitli konaklardan PKR ile türe özgü etkileşimlerin analizini kolaylaştırmak.
