השיטה שלנו משתמשת בבחירת טווח מארחים וסמנים פלואורסצנטיים עבור הדור היעיל וה חלק של וירוס vaccina רקומביננטי במגוון סוגי תאים. טכניקה זו משלבת את המהירות של קומבינציה הומולוגית עם הטבע ללא צלקות של בחירה דומיננטית בלתי צייתנית. בנוסף, אנו מארחים בחירת טווח כדי למנוע את האפשרות של שינויים הנגרמים כימית.
שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לשנות וירוס vaccinia או poxviruses אחרים כדי להביע גנים זרים, למשל, כדי ליצור חיסונים. אם אתה מבצע פרוטוקול זה עם בחירת פלואורסצנטיות בלבד, עליך לוודא שאתה מקרין מספיק וירוסים כדי לזהות רקומביננטים נדירים יחסית ללא לחץ סלקטיבי PKR. שיטה זו מסתמכת על רווח ואובדן של סמנים פלואורסצנטיים כדי לבחור בהצלחה וירוסים שרכשו את קלטות recombination ולזהות וירוסים שיש להם recombined ללא צלקות.
כדי ליצור וקטור קומבינציה מחדש, תחילה להוסיף 17 microliters של מים חינם DNase, 1.2 microliters של כל פריימר, חמישה microliters של חיץ תגובה PCR 5x, ה-DNA תבנית, ו 0.5 microliters של פולימראז DNA לצינור PCR אחד לכל אמפייקון. הוסף מים נוספים DNase חינם להביא את הנפח הסופי בכל צינור ל 50 microliters. ומקום הצינורות לתרמוציקלר.
ממיסים את הדנ"א ב-98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות לפני השימוש ב-25 סיבובים של פרוטוקול PCR תלת-שלבי כמצוין. כדי לדמיין את מוצרי ההגברה על ג'ל 1%agarose, להוסיף 10 microliters של כל מוצר DNA ו 2 microliters של חיץ טעינה לכל באר. הפעל את הג'ל במשך שעה אחת בשמונה וולט לס"מ.
בסוף הריצה, השתמש בערכת מיצוי ג'ל DNA על פי פרוטוקול היצרן כדי לטהר כל אמפייקון. שחררו את האמפילונים מהעמודה עם 50 מיקרוליטרים של מים חופשיים של DNase וצנטריפוגה מיידית. כדי להפוך וקטור שיבוט, תחילה להוסיף מיקרוגרם אחד של הווקטור, 17 microliters של מים חופשיים DNase, 2 microliters של חיץ תגובה, ו 1 microliter של EcoRI לצינור עבור דגירה של שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.
בסוף הדגירה, להוסיף 0.2 picomoles של וקטור ליניארי 10 microliters של מים חופשיים DNase, ו 10 microliters של תערובת מאסטר הרכבה DNA לכל אמפליקון מבודד. דגימות דגירה ב 50 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. בסוף הדגירה, להפוך E.coli מוסמך כימית עם שני microliters של המוצר התאספו על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
צלחת 100 microliters של תאים שהפכו על לוחות אגרוז LB בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר של אמפיצילין. לאחר דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס, בחר מושבות מבודדות היטב לחיסון במרק לוריא בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר של אמפיצילין לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 225 מהפכות לדקה. למחרת בבוקר, השתמש בערכת מיני-מזמזם פלסמיד כדי לבודד את הפלסמידים.
ותבדוק את הריכוז והטוהר של הדנ"א בספקטרופוטומטר. עבור ייצור וירוס רקומביננטי, להדביק monolayer confluent של תאים מתאימים עם הנגיף להיות recombined בריבוי של זיהום של אחד בצלחת שש בארות. ותדיגר את התאים הנגועים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך שעה.
בסוף הדגירה, החלף את העל-טבעי בכל באר ב- DMEM טרי ובשימוש בריגנט transfection זמין מסחרית על פי פרוטוקול היצרן. הוסף שלושה מיקרוגרם של וקטור recombination של עניין לכל באר. מניחים את הצלחת באינקובטור למשך 48 שעות נוספות.
לפני אחזור התאים מכל מצב transfection לתוך צינורות בודדים 1.5 מיליליטר. ואז להקפיא-להפשיר את התאים מאגר שלוש פעמים לפני sonicating lysates וכתוצאה מכך במשך 15 שניות ב משרעת 50%. לאחר מכן, באופן סדרתי 10-פי לדלל את lysate sonicated, שנקטפו מ 10 ל הראשון עד 10 לריכוז השישי ב- DMEM טרי ולהוסיף מיליליטר אחד של כל דילול ל בארות קונפלנטיות בודדות של קו תאים מוכשרים חלבון kinase R.
מניחים את התאים באינקובטור תרבות התא במשך שעה אחת לפני החלפת העל-טבעיים במדיום טרי והחזרת התאים לחממת תרבות התאים. לאחר 24 עד 48 שעות, לזהות את וירוסים רקומביננטי על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי. לוחות מווירוסים רקומביננטיים מבטאים פלואורסצנטיות אדומה עקב שילוב של גן ההיתוך mCherry-E3L.
פלאק לטהר את וירוסים רקומביננטי שלוש פעמים על סוג פראי RK13 תאים. לאחר שלושה סיבובים של טיהור פלאק, להדביק RK13 +E3L + K3L תאים עם דילול סדרתי של ליאזט פלאק. כדי לזהות את הווירוסים שקרסו, על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מערכת הדמיה מתאימה המצוידת בקוביות מסנן GFP ו- RFP.
לאחר מכן פלאק לטהר ירוק בלבד VC-R4, או לוחות E3L חסר צבע שלוש פעמים על RK13 +E3L + K3L תאים. להבטיח כי אין לוחות פלואורסצנטי אדום. להדביק את התאים עם לפחות 100 יחידות להרכיב פלאק כדי להגדיל את הסיכויים שלך לזהות פלאק חסר צבע.
במקרים נדירים, ייתכן שיהיה צורך בסבבי זיהום מרובים. לוחות פלואורסצנטיים אדומים בחלבון קינאז R מוסמך RK13 תאים מעידים על ביטוי ויראלי של mCherry-E3L. ולוחות או לוחות חסרי צבע המבטאים רק eGFP בתאי RK13+E3L+K3L מאשרים את קריסת סמן הבחירה mCherry-E3L.
וירוס רקומביננטי VC-R4, אשר חסר שני אנטגוניסטים חלבון קינאז R לא יכול לשכפל חלבונים קינאז R מוסמך RK13 תאים בעוד הנגיף לכאורה VP872, אשר מבטא E3L הוא שכפול מוסמך. כדי לאשר כי חוסר יכולת זה לשכפל בתאי RK13 נבע רק מאובדן E3L, GFP משופר הוחלף ב- E3L בווירוס VC-R4. הוא יצר וירוס רלוונטי באמצעות אותו פרוטוקול בחירה.
מעניין, בעת ביצוע וירוס זה, לוחות חסרי צבע עולה בקנה אחד עם קריסת סמן הבחירה mCherry-E3L זוהו לפני הבחירה בתאי RK13 +E3L +K3L הנדרשים בדרך כלל כדי לבחור רקומביננטים ללא צלקת. סביר להניח בגלל זהות הרצף המורחבת בין קלטת recombination mCherry-E3L ואת הגן E3L להיות מוכנס לתוך VC-R4. בממוצע 12.6% מהנגיףים שעברו צאצאים עברו קומבינציה עם הפלסמיד המותב, בדומה לתדרים שדווחו בעבר.
כאן, התדירות של לוחות חסרי צבע יחסית ללוחות הכולל RK13+E3L + K3L תאים מוצג, המדגים כי קצב הקריסה ואובדן סמן הבחירה mCherry-E3L התרחשה בתדר של כ 1.8%.. בשלב הראשון באמצעות תאים מוסמכים PKR מבטיח כי כל הלוחות עם וירוס רקומביננטי הכיל. בשלב השני באמצעות תאים לקוי PKR מאפשר זיהוי של וירוס רקומביננטי עם כריתה mCherry-E3L לוקוס.
גישה זו מאפשרת לנו ליצור במהירות וירוסים המכילים גנים אקסוגניים, למשל, לייצור חיסונים המציעים ביטוי של אנטגוניסטים PKR ויראליים שונים. כדי להקל על הניתוח של אינטראקציות ספציפיות למינים עם PKR ממארחים שונים.
