我々の方法は、多様な細胞タイプにおける組換えバクチーナウイルスの効率的かつシームレスな生成のために、宿主範囲選択および蛍光マーカーを使用する。この技術は、相同組換えの速度と一過性の支配的選択の瘢痕のない性質を兼ね備えています。また、化学的に誘発される変化の可能性を排除するために、範囲選択をホストしています。
この方法は、ワクチンを生成するために、例えば、ワクチンを生成するために、例えば、外来遺伝子を発現させるためにワクシニアウイルスまたは他のポックスウイルスを修飾するために使用することができる。蛍光選択のみを使用してこのプロトコルを実行する場合は、PKR 選択的圧力なしで比較的まれな組換え組換え物を検出するのに十分なウイルスをスクリーニングしていることを確認する必要があります。この方法は、蛍光マーカーのゲインと損失に依存して、再結合カセットを獲得したウイルスを選択し、瘢痕のない再結合したウイルスを検出することに成功しました。
組み換えベクターを生成するには、まず、17マイクロリットルのDNaseフリーウォーター、各プライマーの1.2マイクロリットル、5マイクロリットルのPCR反応バッファー、テンプレートDNA、および0.5マイクロリットルのDNAポリメラーゼをアンプリコン当たり1つのPCRチューブに加えます。DNaseフリーウォーターを追加して、各チューブの最終容積を50マイクロリットルにします。そして、チューブをサーモサイクラーに入れます。
示されているように3段階PCRプロトコルの25ラウンドを使用する前に、30秒間摂氏98度でDNAを溶かします。1%アガロースゲルで増幅産物を可視化するには、各DNA製品の10マイクロリットルと各ウェルに2マイクロリットルのローディングバッファーを追加します。ゲルを1時間8ボルト/センチメートルで実行します。
実行の最後に、各増幅を精製するゲル化するメーカーのプロトコルに従ってDNAゲル抽出キットを使用します。50マイクロリットルのDNaseフリーウォーターと即時遠心でカラムから切断コンを溶出します。クローニングベクターを直線化するには、まずベクトルのマイクログラム1マイクログラム、DNaseフリー水17マイクロリットル、反応バッファー2マイクロリットル、EcoRI 1マイクロリットルを37°Cで1時間インキュベーションします。
インキュベーションの終わりに、DNaseフリー水の10マイクロリットルの線形化されたベクターの0.2ピコモール、および各単離された増幅子に10マイクロリットルのDNAアセンブリマスターミックスを加える。1時間摂氏50度でサンプルをインキュベートします。インキュベーションの最後に、標準的なプロトコルに従って組み立てられた製品の2マイクロリットルで化学的に有能な大腸菌を変換します。
LBアガロースプレート上に100マイクロリットルの形質転換細胞をプレートし、1ミリリットル当たり100マイクログラムのアンピシリンを補った。摂氏37度で一晩培養した後、ルリアスープの接種のために十分に孤立したコロニーを選択し、1ミリリットル当たり100マイクログラムのアンピシリンを一晩37度摂氏と毎分225回転で補う。翌朝、プラスミドミニプレップキットを使用してプラスミドを分離します。
そして分光光度計のDNAの濃度と純度を確認します。組換えウイルス生成の場合、6ウェルプレート内の1の感染の多重度で再結合されるウイルスに適した細胞のコンフルエント単層に感染する。そして、感染した細胞を摂氏37度、5%の二酸化炭素で1時間インキュベートする。
インキュベーションの最後に、各ウェルの上澄み物を新鮮なDMEMに交換し、製造業者のプロトコルに従って市販のトランスフェクション試薬を使用します。各ウェルに目的の再結合ベクトルの3マイクログラムを追加します。プレートをインキュベーターに48時間置きます。
各トランスフェクション条件から個々の1.5ミリリットルのチューブに細胞をプールする前に.その後、50%振幅で15秒間得られたライセートを超音波処理する前に、プールされた細胞を3回凍結解凍します。次に、超音波処理された溶解物を連続的に10倍希釈し、新鮮なDMEMで10〜10〜6濃度に収穫し、各希釈の1ミリリットルをプロテインキナーゼRのコンテントセルラインの個々のコンフルエントウェルに加える。
上清を新鮮な培地に置き換え、細胞を細胞培養インキュベーターに戻す前に、細胞培養インキュベーターに1時間細胞を入れます。24~48時間後、蛍光顕微鏡で組換えウイルスを同定する。組換えウイルス由来のプラークは、mCherry-E3L融合遺伝子の統合により赤色蛍光を発現する。
プラークは、野生型RK13細胞上で3回組換えウイルスを精製する。3回のプラーク精製の後、RK13+E3L+K3L細胞にプラーク溶菌の連続希釈液を感染させる。崩壊したウイルスを特定するために、GFPおよびRFPフィルターキューブを備えた適切な画像化システムを用いた蛍光顕微鏡観察を行う。
次いで、プラークは緑色のみのVC-R4、または無色のE3LプラークをRK13+E3L+K3L細胞で3回精製する。プラークが赤く蛍光を発しない。少なくとも100のプラーク形成ユニットで細胞に感染し、無色のプラークを識別する可能性を高めます。
まれに、感染の複数のラウンドが必要な場合があります。プロテインキナーゼRの有能なRK13細胞の赤色蛍光プラークは、mCherry-E3Lのウイルス発現を示す。そして、RK13+E3L+K3L細胞においてeGFPのみを発現する無色のプラークやプラークは、mCherry-E3L選択マーカーの崩壊を確認する。
両方のプロテインキナーゼRアンタゴニストを欠いている組換えウイルスVC-R4は、E3Lを発現する見かけのウイルスVP872が、複製能力がある間、プロテインキナーゼRの有能なRK13細胞で複製することはできません。RK13細胞内で複製できないことがE3Lの喪失によるだけであることを確認するために、強化されたGFPは、VC-R4ウイルスにおいてE3Lに置き換えられた。同じ選択プロトコルを使用して関連するウイルスを生成した。
興味深いことに、このウイルスを作っている間、一般的に瘢痕のない組換え遺伝子を選択するために必要とされるRK13+E3L+K3L細胞で選択する前に、mCherry-E3L選択マーカーの崩壊と一致する無色のプラークが同定された。mCherry-E3L組換えカセットとE3L遺伝子との間の拡張配列同一性がVC-R4に挿入されているためである可能性が高い。子孫のウイルスの平均12.6%は、以前に報告された周波数と同様に、トランスフェクトされたプラスミドとの再結合を受けた。
ここでは、全プラークRK13+E3L+K3L細胞に対する無色のプラークの頻度が示されており、mCherry-E3L選択マーカーの崩壊率および損失が約1.8%の頻度で発生したことを示す。PKRの管轄細胞を使用して最初の段階では、組み換えウイルスを含むプラークのすべてを保証します。PKR欠損細胞を用いた第2段階では、mCherry-E3L遺伝子座の崩壊を伴う組換えウイルスの検出が可能となる。
このアプローチは、例えば、ワクチン産生のために外因性遺伝子を含むウイルスを迅速に生成することを可能にし、異なるウイルスPKRアンタゴニストの発現を提供する。さまざまなホストからのPKRとの種特異的相互作用の分析を容易にする。
