هذه الطريقة تجعل من الممكن لتحديد في كل مكان من البروتين EYFP الموسومة CENP-A. ويمكن أيضا أن تطبق على الإنسان CENP-A البروتين مع اختبارات مختلفة والبروتينات الأخرى. والميزة الرئيسية لذلك هي أنه يمكن استخدامه لتحديد مواقع EYFP CENP-A K124R في كل مكان مع أهمية بيولوجية حاسمة.
ويمكن توسيع نطاقها للتحقيق في التعديلات اللاحقة للترجمة لمجموعة واسعة من البروتينات الوظيفية. تبدأ من خلال إعداد البروتين الخرز ملزمة مع الأجسام المضادة GFP. غسل 25 ميكرولترات من البروتين حبات لكل تفاعل مناعي مع A1 العازلة على الأقل ثلاث مرات لإزالة الإيثانول.
ثم جعل 50٪ حبة الحل مع المخزن المؤقت A1. إضافة اثنين microliters من الأجسام المضادة GFP إلى الخرز. ثم إضافة المخزن المؤقت A1 إلى 20 مرة صافي حجم حبة. تنفيذ دورة من نهاية إلى نهاية في أربع درجات مئوية لمدة أربع إلى 18 ساعة.
يجب تحديد المدة المثلى للدوران تجريبيًا استنادًا إلى كفاءة المناعة. بعد التناوب، الطرد المركزي الخرز في 100 مرة ز لمدة دقيقة واحدة وإزالة غير منضم فائقة. إضافة A1 العازلة لجعل 50٪ حل من الخرز واستخدام 25 ميكرولترات من هذا الحل لكل رد فعل المناعي.
لأداء المناعة، والخلايا ال ليس في A1 العازلة عبر سونيكيشن وتجميد / ذوبان. قياس تركيزات البروتين وتطبيع كميات البروتين بين عينات IP مختلفة. ثم إزالة 5٪ من العينة من كل أنبوب لتشغيل في صفحة SDS.
اخلط بقية المزيج مع 25 ميكرولترات من البروتين A الخرز المرتبطة بالأجسام المضادة لـ GFP وأداء دوران من النهاية إلى النهاية عند أربع درجات مئوية لمدة أربع إلى 18 ساعة. بعد الخلايا في عازلة A وأداء المناعة كما وصف سابقا، والحفاظ على 10٪ من مجموع immunoprecipants لتأكيد EYFP CENP-A في كل مكان وتحديد موقف من كل مكان في كل مكان EYFP CENP-A. استخدام 90٪ أخرى لتحليل قياس الطيف الشامل.
تشغيل عينة الطيف الشامل في 4-12٪ المتاحة تجارياً بروتين هلام Bis-Tris. ثم قم بإجراء تلوين كوز الأزرق Coomassie واستئصال منطقة هلام 50-70 كيلودالتون لتحليل القياس الطيفي الشامل. النرد كل شريحة هلام في قطع صغيرة ووضعها في أنبوب البروتين منخفضة 0.5 ملليمتر ملزمة.
غسل القطع هلام مع 100 ميكرولترات من 50٪ الأسيتونتريل في 25 ميليمولار بيكربونات الأمونيوم. دوامة لهم لمدة 10-15 دقيقة. ثم تدور عليهم وتجاهل supernatant.
بعد الغسيل الأخير، جفف قطع الجل مع مركز فراغ أعلى مقاعد البدلاء لمدة 30 دقيقة. إضافة 10 ميكرولترات من 10 نانوغرام لكل ميكرولتر التسلسل الصف التربسين والسماح للقطع هلام إعادة الترطيب لمدة خمس دقائق. ثم إضافة 25 ميليمولار بيكربونات، فقط بما فيه الكفاية لتغطية القطع هلام وهضمها في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي, نقل هضم هضوب إلى أنبوب سيليكوني 0.65 ملليلتر نظيفة وإضافة 50٪ الأسيتونتريل و 5٪ حل حمض فشكل. دوامة العينة لمدة 10 دقائق. ثم تدور عليه ونقل افرا في أنبوب الاستخراج.
تركيز العينة مرة أخرى إلى اثنين من microliters. ثم إضافة ثمانية ميكروليتر من 3٪ acetonitrile و 2٪ حل حمض فشكل. دوامة لمدة 15 دقيقة وتدور عليه في 16،000 مرات ز لمدة 30 دقيقة.
إجراء عملية الحصول على بيانات MS باستخدام LC-MS/MS باستخدام نظام كروماتوغرافي سائل مقرون بآلة قياس الطيف الكتلي. حقن ثمانية ميكرولترات من العينة في مرحلة عكسية عمود الكروماتوغرافيا السائلة وفصل الببتيدات مع 2-80٪ تدرج من المذيب B في 60 دقيقة بعد اتجاهات المخطوطات. جمع بيانات قياس الطيف الكتلي باستخدام وضع الاكتساب المعتمد على البيانات.
افتح البرنامج التجاري لتحليل بيانات قياس الطيف الكتلي على سطح المكتب. لبدء بحث جديد، انقر فوق الزر LC في القائمة العلوية. ثم انقر فوق الزر إضافة لتحميل ملفات البيانات الأولية MS الأصلي.
حدد معرف البروتين البشري في طريقة المثل كأسلوب البحث في قاعدة البيانات والبحث في ملفات البيانات الأولية MS الأصلي مقابل قاعدة بيانات UniProt homo sapiens. حدد التربسين كما هو الانزيم الهضم وتعيين بقية المعلمات وفقا لاتجاهات المخطوطات. أدخل اسم ملف النتائج وانقر فوق الزر حفظ باسم على يمين القائمة.
ثم حدد مجلدًا لتخزين نتائج البحث وانقر على زر الحفظ. انقر فوق الزر Process لبدء البحث. بعد انتهاء البحث، سيتم تخزين البيانات التي تحمل اسم البحث الذي تم إدخاله تلقائيًا في المجلد المحدد.
للحصول على أطياف MS /MS من أي ببتيد معين، فتح نتائج البحث في برنامج F.Then انقر على البروتين في قائمة البروتين في القائمة العلوية وانقر على الببتيد في القائمة الوسطى. سوف MS / MS من هذا الببتيد تظهر في الجزء السفلي من القائمة. لتصدير أطياف MS/MS وحفظها، انسخ الأطياف ولصقها على تنسيق ملف مناسب.
تم التعبير عن بنيات الجينات من نوع EYFP CENP-A البرية أو متحولة K124R التي تنقذ فقدان CENP-A الذاتية بشكل ثابت عندما تم تنفيذ تكامل الفيروسات الرجعية. لم يتم الكشف عن التعبير عن CENP-A الذاتية بعد سبعة أيام من تحريض إعادة الكومبينيز Cre. تم العثور على كل من نوع EYFP CENP-A البرية والتعبير عن البروتين K124R لتكون على مستوى مماثل للبروتين CENP-A الذاتية الأولية.
أظهر كل من EYFP CENP-A من النوع البري وK124R mutants توطين السنترومير في سبعة أيام بعد تعطيل التعبير المتبقي من CENP-A الذاتية. وأظهرت EYFP CENP-A نوع البرية وK124R متحولة في كل مكان والتفاعل مع HJURP على عكس حالة لوضع علامة أو غير الموسومة CENP-A نوع البرية وK124R متحولة. تم تقييم صلاحية الخلية من خلال إجراء مقايسة المستعمرة خارج 14 يوما بعد تعطيل CENP-A الأليلة الذاتية المتبقية.
وأظهرت كل من نوع EYFP CENP-A البرية وK124R المسوخ عدد مماثل من المستعمرات التي تم إنقاذها بعد 14 يوما من تعطيل CENP-A الأليلة الذاتية المتبقية. كشف قياس الطيف الكتلي IP في كل مكان في lysine 306 في EYFP CENP-A K124R في خلايا CENP-A ناقص F. معا، هذه النتائج تشير إلى أن الانصهار من البروتين كبير الحجم يدفع في كل مكان في ليسين غير K124R في CENP-A الذي يمنع الأصلي K124R نمط ظاهري واحد متحولة.
عند محاولة هذا البروتوكول، استخدم المواد الهلامية البروتينية المتاحة تجارياً بنسبة 4٪12٪ Bis-Tris لتشغيل عينات قياس الطيف الكتلي. إضافة التربسين كافية لقطع هلام وإعادة هيدرات لهم حتى تم امتصاص جميع الانزيمات. إن تقنية وضع علامات على الوزن الجزيئي أو التحقق مطلوبة في الواقع لتصور كل مكان وتحقيق إشارات في كل مكان من البروتين الزماني على مستوى الكائنات الحية بأكملها.
